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cPRL是线虫体内的一种酪氨酸磷酸酯酶(PTPs)，属于蛋白酪氨酸磷酸酶的亚家族。蛋白酪氨酸磷酸酶家族是由许多不同的酶组成的。这些酶在各种细胞进程中起着重要的作用。其中一些酶对磷酸酪氨酰残基具有专一性，其它的酶对Ser/Thr和Tyr都发挥作用。蛋白磷酸化作用由蛋白激酶和磷酸酶协同作用来控制。在细胞增殖、分化和变异中起着极其重要的作用。 在本研究中，我们将使用线虫作为模型体系来研究cPRL。线虫作为生物研究模型最初是由Sydney Brenner于1965年创始的，由此他获得了2002年诺贝尔奖。在实验室培养线虫非常容易而且经济。线虫生长较快，从虫卵发育到可产卵的成虫这一整个生命周期只需要20℃3.5天即可。近几年有报道说明，在线虫体内用RNAi技术敲掉一些特定的酶将对线虫的一些行为产生明显的影响，用来说明这些特定的酶具有重要的生物学功能。我们实验的目的就是要研究cPRL的生物化学和生物学功能。通过研究cPRL酶的生物化学功能和特性，揭示调节该酶的机理，阐明线虫中cPRL的生物化学活性与生物学功能两者之间的相关性。 RNAi已经成为线虫反义基因组学主要的研究手段，它可以通过显微注射或浸泡dsRNA以及喂养能产生dsRNA的E. coli等方法达到使目的基因沉默的效果。我们选择以喂养线虫的方法产生RNAi效应。此方法简单而且重复性好，诱导出的亚型在持续喂养的条件下可维持数代，因此可以很简便的检验特异性基因RNA干扰产生的生物学效应。我们选用pPD129.36质粒做为cPRL的dsRNA表达载体, 由于此载体在插入片段两端具有双相T7启动子,在诱导剂IPTG下很容易合成正义及反义的dsRNA。我们将在pPD129.36质粒载体中插入目的cDNA片段，然后在E. coli HT115(DE3) 中扩增并诱导表达dsRNA。<WP=60>HT115有一个Rnc基因突变，它是编码特异性降解dsRNA的内切酶RNaseIII的基因。另外，此菌含有(DE3 lysogen, 它可在T7启动子的控制下进行基因转录。RNAi作用机制分为两个过程，首先，dsRNA被切割为小RNA片段。然后，后者会使与dsRNA具有同源序列的mRNA被切割降解。在线虫中，每个细胞只需要少许dsRNA分子既可以使数千个目的mRNA基因沉默。我们将表达过的E. coli HT115 接种含有Amp、Tep和IPTG的NGM平板上，用于喂养线虫并进行RNAi线虫亚型变化的观察研究。论文研究取得了如下结果：1. 成功的克隆了cPRL的cDNA序列并表达了相应的dsRNA 我们用PCR技术扩增了cPRL基因序列，验证的结果正确。构建了cPRL基因的克隆载体pBluescript II KS－cPRL，酶切结果验证正确。经过重组筛选E. coli DH5α，LB+Amp筛选阳性克隆。从克隆载体上获得目的基因，经EcoR I和HindⅢ双酶切，连接pPD129.36表达载体，核酸电泳鉴定结果正确。将表达载体转化E. coli HT115(DE3) ，加入诱导剂IPTG表达后，接种于含有Amp、Tep和IPTG的NGM平板上用于喂养线虫。通过Western blot验证线虫体内cPRL表达，确定cPRL的dsRNA表达的结果正确。2. RNAi线虫亚型变化结果我们在进行RNAi线虫亚型观察实验前，要先将卵进行同期化处理：选取10条（或更多）生殖期的野生型（wild）线虫N2分别放入Control组及RNAi组的平板中让其产卵。其中Control组平板中接种的E.coli HT115含有未构建入cPRL基因的pPd129.36m的空质粒,而RNAi组平板中接种的E.coli HT115含有构建入cPRL基因的pPd129.36质粒并在诱导剂IPTG诱导下表达出dsRNA。我们在进行卵的同期化后，观察了RNAi线虫成虫期的生命周期(Life-span)、运动能力(Locomotion)、气味诱导剂产生的趋化作用<WP=61>(Chemotaxis)、产卵(Egg-laying)数目、吞咽(Pharyngeal pumping)食物次数及排便(Defecation)次数的变化。 将数据结果进行了统计学分析。数据分析的结果表明：RNAi线虫在趋化作用方面与Control组没有任何区别。但是在趋化作用上的数据结果并不能说明cPRL基因与线虫的神经系统无关。所以在这个方面我们今后将采取其它的方法与之对照来验证。RNAi线虫在生存能力、运动能力、产卵总数、吞咽食物的次数和排便的间隔时间上与Control组线虫有着一定的区别。这预示着cRPL基因与线虫的肌肉系统有着较为密切的关联，干扰cPRL基因的正常功能表达可能对相应肌肉系统及其组织的正常功能产生正相关或负相关的影响。 本实验通过观测RNAi线虫生物学形态的变化，初步确定了cPRL的生物学功能。但深入的研究还要结合免疫荧光技术及cPRL相关家族酶的研究，这样在了解cPRL功能的同时也可以确定其功能作用的专一性，既去掉与该家族其它酶的功能与之有共性的部分，有利于进一步研究cPRL的生物学功能。