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益生菌是一类定植于宿主肠道、帮助宿主改善体内微生态平衡,发挥有益作用的活性微生物,随着后抗生素时代的到来,益生菌作为抗生素的最佳替代品之一,在畜牧养殖业中得到广泛应用。本试验主要从益生菌株的筛选、复合益生菌制剂的制备工艺及其在反刍动物生产中的应用开展研究。1.屎肠球菌筛选与复合益生菌的制备工艺本试验从山羊瘤胃中筛选的菌株,采用琼脂平板划线分离,形态学观察,生化鉴定及16S rDNA基因序列分析,鉴定结果为屎肠球菌;该菌株具有良好的生长特性,对pH2.5-3.5人工胃液和0.2%-0.3%胆盐人工肠液具有较好的耐受性,对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均能产生明显的抑制作用。采用分离的屎肠球菌(Enterococcus faecium,LB-01)与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CICC23138)进行共发酵培养制备的复合益生菌制剂,种子液最佳培养时间为12h;最佳发酵工艺参数为:发酵时间15h,发酵培养基添加量10%,种子液接种量10%;发酵培养过程稳定,能满足工厂化生产要求;复合益生菌制剂在不同季度随着存放时间的延长,其总活菌存活率呈下降趋势,且不同季度下降幅度有差异,其中第3季度活菌存活率下降幅度最大,第4季度和第2季度次之,第1季度活菌存活率下降幅度最小。2.复合益生菌制剂对奶牛生产性能及血液理化指标的影响选择年龄、胎次、产奶量、泌乳天数(112±8.5天)相近的健康荷斯坦奶牛24头,采用随机分组试验设计方案分为4组,即对照组和试验1、2、3组,每组6头,对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加5、10、15g/(头·天)复合益生菌制剂,预试期7天,正试试验期35天。结果表明,奶牛日粮中添加复合益生菌制剂能显著提高产奶量(p<0.05),改善乳品质,显著降低乳汁中体细胞数量(p<0.05),提高血清球蛋白含量(p<0.05),增强免疫功能,综合投入产出比以复合益生菌制剂10g/(头·天)的添加剂量为宜。3.复合益生菌制剂对大肠杆菌感染的山羊肠道防御机能影响本试验选择健康成年雌性山羊18头,体重20±3kg,研究复合益生菌制剂预防山羊肠道感染大肠杆菌的试验效果和复合益生菌对山羊肠道大肠杆菌感染的治疗效果,预防试验分为3组,对照组、大肠杆菌组和益生菌预防组,每组3头,试验第1-4天,对照组和大肠杆菌组山羊每天灌服30mL生理盐水,益生菌预防组山羊每天灌服30mL复合益生菌制剂,试验第5-6天,对照组山羊每天灌服30mL生理盐水,其余2组山羊每天灌服30mL大肠杆菌;治疗试验分为3组,对照组、大肠杆菌组和益生菌治疗组,每组3头,试验第1-2天,对照组山羊每天灌服30mL生理盐水,其余2组山羊每天灌服30mL大肠杆菌,试验第3-6天,对照组和大肠杆菌组山羊每天灌服30mL生理盐水,益生菌治疗组每天灌服30mL复合益生菌制剂。试验期11天,分别于试验第1、3、5、7、9和11天,测定各组山羊的体温、呼吸频率和心率,采集山羊血液进行白细胞计数;预防试验在试验第7和11天,治疗试验在试验第3和9天,通过外科手术取样观察肠道病理学变化,测定肠道菌群数量和肠道黏膜组织炎性因子IL-1β、IL-8和TNF-α基因表达量,结果如下:(1)山羊生命体征和白细胞数量的变化预防试验:与对照组相比,试验第7-11天,大肠杆菌组生命体征指标和白细胞数量均升高(p<0.01或p<0.05),益生菌预防组在试验第7天升高(p<0.05),之后均恢复正常,且体温、呼吸频率和白细胞数量低于大肠杆菌组(p<0.05)。治疗试验:与对照组相比,试验第3-9天,大肠杆菌组生命体征指标和白细胞数量均升高(p<0.01或p<0.05),益生菌治疗组仅在试验第3-5天升高(p<0.01或<0.05),试验第5-9天,生命体征指标和白细胞数量均恢复正常且显著低于大肠杆菌组(p<0.05)。(2)山羊肠道病理组织学的变化预防试验:与对照组相比,大肠杆菌组空肠肠壁变薄,盲肠充血,空肠绒毛长度、隐窝深度和V/C 比值和盲肠黏膜层厚度降低(p<0.01或p<0.05),与大肠杆菌组相比,益生菌预防组空肠和盲肠病变明显好转,空肠绒毛长度、隐窝深度和V/C比值和盲肠黏膜层厚度升高(p<0.01或p<0.05)。治疗试验:与对照组相比,大肠杆菌组空肠内容物呈水样,盲肠充血和胀气,空肠绒毛长度、隐窝深度、V/C 比值和盲肠黏膜层厚度均降低(p<0.01或p<0.05),与大肠杆菌组相比,益生菌治疗组空肠绒毛长度、V/C比值和盲肠黏膜层厚度均升高(p<0.01或p<0.05),且临床症状明显缓解。(3)山羊肠道菌群数量的变化预防试验:与对照组相比,试验第7和11天,大肠杆菌组空肠和盲肠乳酸菌数量均降低(p<0.05),大肠杆菌数量均增加(p<0.01),与大肠杆菌组相比,益生菌预防组空肠和盲肠大肠杆菌数量均降低(p<0.05)。治疗试验:试验第3和9天,大肠杆菌组空肠和盲肠乳酸菌数量降低(p<0.01或p<0.05),空肠和盲肠大肠杆菌数量增加(p<0.01);试验第9天,与大肠杆菌组相比,益生菌治疗组空肠和盲肠乳酸菌数量增加(p<0.05),大肠杆菌数量降低(p<0.01)。(4)山羊肠道黏膜组织炎性因子基因表达的变化预防试验:试验第7和11天,与对照组相比,大肠杆菌组空肠和盲肠黏膜炎性因子表达量升高(p<0.01),与大肠杆菌组相比,益生菌预防组空肠和盲肠黏膜炎性因子表达量降低(p<0.01或p<0.05)。治疗试验:试验第3和9天,与对照组相比,大肠杆菌组和益生菌治疗组空肠和盲肠黏膜炎性因子表达量升高(p<0.01或p<0.05);与大肠杆菌组相比,益生菌治疗组肠道黏膜炎性因子表达量降低(p<0.01或p<0.05)。