论文部分内容阅读
UBIAD1(ubi A prenyltransferase domain-containing protein 1)是一个九次跨膜的异戊烯转移酶,具有体内合成维生素K2(MK4)和辅酶Q10(Co Q10)的功能,在很多生物学过程中发挥着重要作用。UBIAD1是线粒体维生素K的合成酶,可以调节线粒体电子传递链,稳定线粒体膜电势和影响ATP合成,UBIAD1缺失导致线粒体功能丧失,引起帕金森疾病。UBIAD1参与高尔基体上Co Q10合成,调节内皮型一氧化氮合酶(e NOS)活性,进而调控细胞氧化还原过程,UBIAD1缺失使e NOS解偶联,导致大量活性氧(ROS)积累,从而对细胞造成氧化损伤,引起心血管相关疾病发生。UBIAD1通过与HMG-Co A还原酶相互作用参与胆固醇合成,调节细胞内脂质代谢,UBIAD1定点突变阻止HMG-Co A还原酶降解并导致脂质大量堆积,引起施耐德结晶状角膜营养不良症(SCCD)。另外UBIAD1在肿瘤发生过程起着作用,在膀胱癌,前列腺癌和肾癌中UBIAD1表达量下调,在这些癌症细胞内外源转入UBIAD1会导致细胞生长受到抑制。本实验室以前的研究发现,UBIAD1缺失激活Ras/MAPK信号通路,但其作用机制并未研究清楚。基于此,在本文中,我们探索UBIAD1调节Ras/MAPK信号通路的相关机制。我们研究发现外源表达UBIAD1抑制膀胱癌T24细胞内Ras/MAPK信号、T24细胞活力和细胞增殖,并且UBIAD1缺失会激活Ras/MAPK信号通路。选用不同的Ras/MAPK信号通路抑制剂处理缺失UBIAD1的细胞发现,UBIAD1在Ras/MAPK中的作用位点是Ras蛋白。为了进一步探究UBIAD1蛋白对H-Ras的作用,通过共聚焦显微镜观察发现,UBIAD1阻止H-Ras转运,使其在高尔基体滞留;沉默UBIAD1导致H-Ras在细胞膜上聚集。通过蛋白共定位分析、蛋白荧光能量共振转移技术、蛋白双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验方法确定了UBIAD1与H-Ras蛋白的相互作用。通过截短体实验发现UBIAD1与H-Ras的羧基端存在相互作用。利用他汀类药物抑制UBIAD1的底物(香叶基香叶基焦磷酸GGPP)来源和利用RNAi沉默GGPPS(GGPP合成酶)特异性的减少细胞内GGPP,通过免疫共沉淀、激光共聚焦、免疫印迹和细胞活力检测我们发现他汀类药物和si-GGPPS可以有效的抑制UBIAD1的功能:UBIAD1和H-Ras的相互作用,UBIAD1对H-Ras的滞留现象,UBIAD1对Ras/MAPK信号通路抑制和UBIAD1抑制T24细胞增殖现象,从而说明GGPP在其中发挥着重要的作用。此外,由于UBIAD1在高尔基体上合成Co Q10并调节e NOS活性,所以e NOS可能参与UBIAD1-H-Ras蛋白复合体中,为了验证此假设,我们利用L-NAME(e NOS抑制剂)实验发现,L-NAME可以减少UBIAD1-H-Ras的相互作用和消除UBIAD对H-Ras的抑制作用。通过免疫共沉淀发现UBIAD1/e NOS/H-RAS之间存在相互作用。为了验证UBIAD1-e NOS-H-Ras复合体在生物体内的作用,我们用果蝇作为动物模型发现,heix(UBIAD1的同源基因)缺失会导致黑色素瘤发生。Ras/MAPK信号通路抑制剂和Ras抑制剂显著抑制肿瘤发生,从而说明果蝇黑色素瘤发生与Ras/MAPK信号通路相关。另外我们发现他汀类和L-NAME可以促使果蝇黑色素瘤的形成。动物实验数据都和细胞实验相符合,说明果蝇黑色素瘤的形成与UBIAD1-e NOS-Ras复合体相关的。综上所述,在我们的研究中,UBIAD1/e NOS/H-Ras相互作用,使H-Ras滞留在高尔基体,阻止H-Ras转运至细胞膜,进而抑制Ras/MAPK信号通路和膀胱癌T24细胞活力。而UBIAD1缺失则会使Ras转运至细胞膜和使e NOS解偶联,激活细胞内Ras/MAPK信号和产生大量活性氧,促进细胞增殖,最终引发肿瘤。因此,我们研究结果可以很好的为探索UBIAD1在抑制膀胱癌的生长的机制,治疗膀胱癌药物研发和预防肿瘤发生的方法提供理论基础。