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目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的黏附、增殖与迁移是高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础。其中VSMC的黏附是介导其增殖和迁移的关键环节,对维持细胞的生存和正常血管壁结构至关重要。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是维生素A的衍生物,能够诱导多种肿瘤细胞分化和凋亡。本实验通过观察ATRA对体外培养的VSMC黏附以及相关黏附分子表达的影响,试图揭示ATRA抑制增殖诱导凋亡的作用机制。方法:1 VSMC的培养及ATRA处理1.1 VSMC的培养:取5周龄SD大鼠胸腹主动脉,按贴块法分离培养VSMC。每隔3 d换液一次,至细胞呈单层汇合后,以0.25 %胰蛋白酶消化传代,取3～6代细胞进行实验。传代培养的VSMC生长到70～80%汇合时,给予全反式维甲酸刺激。1.2 ATRA处理:用10μM的ATRA分别处理VSMC 0,24,48 h,确定ATRA的时效关系。分别用0,5,10μM ATRA处理VSMC 48 h,确定ATRA的量效关系。2 VSMC黏附试验取3～6代的VSMC,血清饥饿使细胞同步化于静止期。按照分组给予不同时间剂量ATRA刺激。然后,将VSMC用胰蛋白酶消化,接种于96孔板在规定的时间内取出孔板,用4%多聚甲醛室温固定,光镜下观察黏附的细胞并计数。随后用甲苯胺蓝染色,裂解细胞后,于λ595 nm测吸光度值,计算细胞黏附活性。3 VSMC黏附分子的表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1 )和血管细胞间黏附分子-1 ( vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)是VSMC正常表达的黏附分子,在VSMC黏附中起重要作用。按照分组给予体外培养的VSMC不同剂量、时间的ATRA刺激,使用免疫细胞化学染色法和Western Bolt观察两种蛋白的表达变化;用Trizol一步法提取各组VSMC的总RNA,反转录后,经半定量RT-PCR观察基因的转录活性。结果:1不同时间、剂量ATRA对VSMC黏附的影响将ATRA预处理的VSMC接种于96孔板,置于37℃一定时间后,观察细胞贴壁情况。细胞计数结果表明,ATRA能够降低VSMC的黏附能力,给予终浓度10μM ATRA后,与对照组相比,24 h组和48 h组VSMC黏附数量随ATRA预处理的延长均较对照组有所下降,分别为对照组的85.8%(P>0.05)和35.3%(P<0.05);用不同浓度(5,10μM)ATRA处理VSMC 48 h后,5μM组和10μM组VSMC黏附数量随剂量增加均较对照组有所下降,分别为对照组的59.1%和34.7%(P<0.05)。同样条件下,甲苯胺蓝染色试验结果经统计分析与细胞计数结果一致。2不同时间、剂量ATRA对VSMC黏附分子表达水平的影响免疫细胞化学染色结果显示,在未经ATRA处理的VSMC中,ICAM-1和VCAM-1染色为棕褐色颗粒,着色较深,均匀分布于细胞表面。ATRA预处理的VSMC中ICAM-1、VCAM-1蛋白阳性着色颗粒减少。给予终浓度10μM ATRA刺激后,与0 h组相比,24 h组和48 h组VSMC细胞膜表面ICAM-1、VCAM-1染色明显变浅;给予不同剂量ATRA刺激48 h后,5μM组和10μM组VSMC的ICAM-1、VCAM-1表达量较未处理组明显减少。半定量RT-PCR结果显示,ATRA可以下调VSMC中ICAM-1、VCAM-1基因的转录活性。给予终浓度10μM ATRA刺激后,与0 h组相比, 24 h组和48 h组的ICAM-1 mRNA水平分别降低了16%和47%;VCAM-1 mRNA水平分别下降了32%和48%。用不同浓度ATRA处理VSMC后,ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达呈剂量依赖性减少,5μM ATRA即可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分别降低50%和29%;10μM ATRA可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分别下降54%和51%。Western Bolt结果显示,ATRA能够抑制ICAM-1、VCAM-1蛋白表达。给予终浓度10μM ATRA处理VSMC后,与对照组相比,24 h组和48 h组的ICAM-1蛋白表达随刺激时间延长而下降,分别为对照组的85.8%(P>0.05)和57.6%(P<0.05);两组的VCAM-1蛋白表达亦随刺激时间延长而下降,分别为0 h组的80.1%(P>0.05)和63.6%(P<0.05)。与RT-PCR结果相似,5μM组和10μM组ICAM-1蛋白表达随剂量增加逐步下降,分别为0μM组的52.9%和46.4%(P<0.05);VCAM-1蛋白表达亦随时间延长而下降,分别为对照组的50.6%和44.6%(P<0.05)。结论:1 ATRA可抑制VSMC的黏附活性,其抑制效应呈剂量依赖性和时间依赖性。2 ATRA可以在转录和翻译水平上,以剂量和时间依赖方式抑制ICAM-1和VCAM-1基因转录和蛋白表达。3 ATRA抑制黏附分子表达与其抑制VSMC黏附活性具有正相关关系。