高血压是心肌梗死、脑卒中、心力衰竭和慢性肾脏病等心血管疾病的重要风险因子，积极构建高血压防控社会系统工程、开发新型降血压药剂和营养素是预防和治疗高血压病的首要任务。肾素-血管紧张素系统（RAS）是调节机体血压正常、维持体液平衡的重要系统，肾素和血管紧张素转化酶-I（ACE）抑制剂可以降低因RAS系统紊乱而导致的高血压。食物源降血压肽因其营养、安全已经被用于降血压相关的功能食品和保健品的开发。本研究采用蛋白酶水解菜籽蛋白释放出具有肾素和ACE双重抑制活性的菜籽肽，可为相关食物源双重抑制肽的研究和开发提供实验依据。首先，应用商业化内切蛋白酶Alcalase、蛋白酶k、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶+胰酶（P+P）和风味蛋白酶水解菜籽分离蛋白质，通过现代膜分离技术将菜籽蛋白质水解物分离分成4种不同分子量大小的组分（<1kDa,1-3kDa,3-5kDa和5-10kDa），探讨了不同蛋白酶水解物及其膜分离组分的抗氧化性、肾素抑制活性、ACE抑制活性和降血压活性。研究发现，Alcalase水解菜籽蛋白获得的水解物的得率较高，而风味蛋白酶水解物得率相对较低；膜分离后，<1kDa组分的得率最多，说明蛋白酶可以有效地把菜籽蛋白水解成低分子量多肽。Alcalase和蛋白酶k水解物及其膜分离组分具有较弱Fe3+还原能力，但是具有较好的氧自由基吸附能力和抑制亚油酸氧化的能力，而P+P和风味蛋白酶水解物及其膜分离组分表现出较差的抗氧化能力；与>1kDa多肽组分相比，<1kDa的肽组分具有较强的氧自由基吸附能力和Fe3+还原能力，但是Fe2+螯合能力相对较弱。Alcalase、蛋白酶k和嗜热菌蛋白酶的水解物具有较高的ACE抑制活性，并且在所有测试的样品中，Alcalase水解物具有最强的肾素抑制活性。自发性高血压大鼠（SHRs）实验表明灌胃菜籽蛋白水解物（100mg/kg体重）8小时后，Alcalase水解物能够有效的将降低SHRs的血压（~24mmHg），而蛋白酶k水解物最大只能降低SHRs~5mmHg的血压；P+P水解物则表现出长期降血压效果，灌胃24后仍然可以降低SHRs~24mmHg的血压。研究认为，菜籽蛋白质Alcalase水解物和P+P水解物（尤其是<3kDa的水解物）可以作为有效的降血压添加剂应用于功能食品和保健品的开发。选择Alcalase和P+P（<3kDa）的水解物进一步进行分离纯化，寻找其中可能存在的具有肾素和ACE双重抑制活性的降血压肽。其次，菜籽蛋白Alcalase水解物先后经过2次制备型和2次分析型反相色谱柱分离后，再经质谱鉴定其结构，获得3个活性较高的肾素和ACE双重抑制肽Thr-Phe(TF)，Leu-Tyr (LY)和Arg-Ala-Leu-Pro (RALP)。与TF（IC50,0.65mmol/L）和RALP（IC50,0.81mM）相比，LY（IC50,0.11mmol/L）具有较高的ACE抑制活性；而RALP（IC50,0.97mmol/L）表现出较强的肾素抑制活性（LY,1.87mmol/L； TF,3.1mmol/L）。SHRs实验结果表明，在30mg/kg bw剂量下，灌胃24h内，LY和RALP分别最高降低SHRs的血压达~26和~16mmHg，而TF只能降低SHRs~12mmHg的血压。研究认为LY和RALP中含有的疏水性氨基酸残基有助于提高其降血压活性，是潜在的降血压剂。另外，<3kDa的P+P水解物通过凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离后，获得了降血压肽Gly-His-Ser (GHS)。GHS对ACE和肾素抑制活性的IC50值分别是1.74mmol/L和1.07mmol/L。在30mg/kg bw剂量下，灌胃GHS后，最高可以降低SHRs~17mmHg的血压，与从Aclalase菜籽蛋白水解物中获得的降压肽RALP的降血压活性相当。再次，在获得菜籽蛋白源双重抑制肽的基础上，通过酶抑制动力学实验、荧光光谱和圆二色光谱技术以及分子对接，探讨了菜籽降血压肽TF、LY和RALP与ACE和肾素的相互作用。结果发现，TF对ACE的抑制模式可能是反竞争抑制型，而LY和RALP对ACE的抑制模式是竞争抑制型；TF对肾素的抑制模式是非竞争抑制型，而LY和RALP对肾素的抑制模式是混合抑制型。TF主要是通过与ACE分子发生动态碰撞而猝灭ACE内荧光，LY和RALP可以通过与ACE活性位点静态结合来猝灭ACE的内荧光；TF可以和肾素的2个活性位点静态结合猝灭其内荧光，而LY和RALP猝灭肾素内荧光的方式是同时发生静态结合与分子间的动态碰撞。菜籽肽诱导的ACE和肾素二级结构的改变，因菜籽肽种类和浓度的不同有很大差异。例如，在低浓度下（12.5μg/mL），LY与ACE的相互作用会导致ACE分子无规则二级机构的增加（38.03±1.21%）和α-螺旋、β-串结构的减少，而进一步增加LY浓度（25μg/mL），会使α-螺旋、β-转角结构转化成β-串结构（42.80±0.17%）；12.5μg/mL下，RALP与肾素的相互作用，会使肾素的有序结构β-串和β-转角转化成α-螺旋（10.93±1.15%），而高浓度的RALP，几乎使所有的α-螺旋β-折叠转化成无规则结构（83.05±0.07%）。与TF和RALP相比，LY与ACE分子具有更好的对接效果和更大的亲和力；虽然RALP的分子量大于TF和LY，但是其与肾素活性中心的重要氨基酸之间形成了更多的稳定分子结构的氢键。最后，研究了电场力驱动的电渗析-膜分离技术（EDUF）对菜籽蛋白Alcalase水解物（ORPH）的分离效果。结果发现EDUF主要将ORPH分离成阳离子肽、阴离子肽和分离残留的水解物（FRPH），其对ACE抑制活性的IC50值分别为0.0932±0.0037、0.1439±0.0044、0.3146±0.0101和0.1034±0.0024mg/mL，对肾素抑制活性的IC50值分别为0.68±0.12、0.56±0.07、0.89±0.17和0.47±0.05mg/mL；在100mg/kg bw剂量下，灌胃ORPH和FRPH6h后，最大降低SHRs的血压分别为~47和~51mmHg，并且在24小时观察时间内，EDUF分离组分FRPH的降血压效果都要好于ORPH和药用降血压剂卡托普利（Captopril,10mg/kg bw）。与ORPH相比，FRPH引起的较好的降血压效果可能是由于其具有较高的肾素抑制活性的原因。另外，在测试的24h内，阳离子肽具有与卡托普利相似的降血压效果。总的来说，以碱性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕获得的菜籽蛋白水解物经电渗析-膜分离技术分离后获得了降血压效果较好的FRPH和阳离子肽。