研究背景骨质疏松症引起髋部、脊椎、盆和手腕的骨折风险提高,造成残疾甚至死亡。骨质疏松的治疗应该得到更多的重视。骨骼的发育和维持依赖于两种重要的细胞成骨细胞和破骨细胞的相互作用。成骨细胞分化的间充质前体通常是骨形成所必需的,它是由几个转录因子严格控制并被周围的细胞或组织通过细胞间信号影响。据报道,Wnt/β-catenin信号的活化能明显被成骨诱导因子触发,即使在乙醇能增加骨髓多向分化潜能间充质干细胞由成骨向脂肪细胞的作用情况下,成骨诱导因子也能活化Wnt/β信号肽。Wnt蛋白信号分子能影响细胞的增殖、分化和生存。经典Wnt信号通路利用Wnt蛋白、卷曲蛋白(Frizzled,FZD)、和低密度脂蛋白受体相关蛋白-56(LRP5/6)受体之间的成簇作用,引起磷酸化作用,从而通过抑制糖原合成酶激酶-3(GSK-3)稳定β-catenin。非磷酸化β-catenin积聚在细胞核内,结合淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF)转录因子而磷酸化β-catenin被降解。激活LEF/TCF转录因子可以使成骨细胞的特定基因表达。严重的骨质疏松症中可以看到破骨细胞生成抑制因子的缺乏和水溶性破骨细胞分化因子的过度表达。柚皮苷可以促进成骨作用并抑制破骨作用。据报道,在大鼠UMR-106细胞中柚皮苷发挥雌激素样活性,能显著提高细胞增殖、总蛋白含量和碱性磷酸酶(ALP)活性。此外,激活P13K、Akt,c-fos/c-jun和AP-1通路被发现参与刺激柚皮苷对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在MC3T3-E1成骨细胞中的表达。研究目的本研究旨在探讨柚皮苷对成骨细胞和骨发育的影响。为了揭示了柚皮苷的作用机制,我们研究了在柚皮苷在体外对成骨样UMR-106细胞和小鼠体内骨骼发育作用过程中,二氢脱氧吗啡阻断AMP激活的蛋白激酶(AMPK)和akti-1/2抑制Akt 1、2的影响。材料和方法实验动物24周龄SD雌性小鼠,五只试验鼠行假手术,其余小鼠行卵巢切除术(OVX)从而在一个月时引起的骨丢失。恢复2周后,OVX小鼠随机分为三组:OVX溶剂组(PBS),OVX柚皮苷(5 nM)组和OVX柚皮苷与PTH组。对照组为假手术。对照组小鼠按对照饮食成对喂养,按以前的研究给予口服药物治疗6周。在治疗结束后,从股骨、胫骨和腰椎收集标本后保存在-20℃条件下直至分析。柚皮苷的提取与鉴定从3公斤的骨碎补提取10.5毫克柚皮苷,并用高效液相色谱分析(HPLC)。大鼠成骨UMR-106细胞的培养培养UMR-106细胞,相应的96、24或6孔板条件下分别进行不同的分析。再培养72H后对不同浓度的柚皮苷(0,0.5,1,5,10和20 nm)进行检测,确定哪种浓度对细胞增殖的影响最大。为了评估mRNA和β-catenin表达水平,溶剂(PBS)作为对照,将细胞分别用Wnt3a(10毫微克/毫升),DKK1(100毫微克/毫升)、柚皮苷(10nM),柚皮苷(10nM)+ DKK1(100纳克/毫升)和柚皮苷(10nM)+ FH535(10μM)处理。将细胞分为四组:对照组、柚皮苷(10nM)组、柚皮苷(10nM)+二氢脱氧吗啡(100nM)、和柚皮苷(10nM)+Akti-1/2(200nM)组。细胞核和细胞质的分离根据使用说明书使用核提取试剂盒分离细胞核和细胞质,所有样品储存在-80℃条件下直至使用。细胞增殖分析细胞增殖率用BrdU掺入法。以BrdU抗体用BrdU染色试剂盒行细胞固定并染色。O.D(Optical Density,光密度)在450 nm处测定。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析所有细胞RNA的提取都是利用RNeasy Mini Kit试剂盒。通过Nanodrop 8000分光光度计测定RNA的质量和数量。按照产品说明书使用高容量的cDNA逆转录试剂盒,每次用1000纳克RNA用于反应中产生cDNA。反应在25℃、5分钟条件下开始,退火温度50℃,延长温度在70℃。在基因表达分析之前,cDNA产物添加RNase and DNase free纯水稀释至250 μl并在-20℃冻结。每一个聚合酶链反应混合物中,含有10μl1 ×PCRmastermix、5μl稀释的cDNA、4 μ l纯水和1 μ l探针。用实时定量RT-PCR系统检测基因表达。Western blot分析β-catenin(～92kDa)的表达由Western blot法检测。仔细用TTBS洗涤减少背景颜色。结果使用ECL试剂显影,用GeneGnome仪器观察。瞬时转染和er介导的荧光素酶活性测定LipofectamineTM 2000 reagent转染细胞。Er介导双荧光素酶质粒转染。细胞分别和溶剂、柚皮苷(10nM))或者柚皮苷与DKK1(100ng/ml)反应24h。处理后的细胞被裂解缓冲液裂解,采用双荧光素酶检测荧光素酶活性。由td-20/20光度计检测报告分析系统和信号。碱性磷酸酶分析和溶剂、柚皮苷或者PTH反应后,在一个90-6-孔的微量培养板的单层直接测量碱性磷酸酶的活性。在酶标仪405 nm处测定吸光度的颜色变化。进行Bradford蛋白质分析使ALP表达标准化,ALP活性以U/L每毫克蛋白表达。通过外周定量CT(pQCT)评估骨性能用StraTecXCT2000机测量在股骨远端、胫骨近端和腰椎L1区测量骨密度(BMD)、横截面积和应力-应变指数(SSI)。对股骨和胫骨的干中和远端/近端区域进行扫描。所有扫描都使用研究孤立的小骨头的设计方案。骨硬度测量使用指定的三点弯曲试验测量骨的刚度。并同时绘制的载荷-变形曲线。从载荷-变形曲线确定骨刚度。结果柚皮苷增强Wnt/β-catenin信号通路。我们首先检测了不同浓度柚皮苷对UMR106细胞增殖影响。随着柚皮苷浓度的增加从0.5nM到10nM,细胞增殖明显加快。取10nM作为在进一步研究柚皮苷在Wnt/β-catenin信号通路功能的最佳用量。为研究β-catenin调控柚皮苷的影响,将UMR-106细胞分为六组:对照组,Wnt3a组、Dkk1组、1Onm柚皮苷组,DKK1 +柚皮苷组,FH535+柚皮苷组,在mRNA水平的测定每组β-catenin。与对照组比较,柚皮苷治疗显著提高β-catenin的mRNA水平(P<0.01)。DKK1 +柚皮苷组和FH535+柚皮苷组处理较对照组显著降低βcatenin的mRNA水平(DKK1 +柚皮苷组,P<0.05;FH535+柚皮苷组,P<0.01)。与柚皮苷治疗比较,DKK1 +柚皮苷和FH535+柚皮苷持续抑制β-catenin mRNA水平。Western blot分析,Wnt3a的蛋白大幅提高β-catenin表达(P<0.001),而DKK1的导致β-catenin水平显著降低(P<0.01)。柚皮苷治疗能明显促进β-catenin的表达(P<0.01)。同时也观察到,DKK1 +柚皮苷和FH535+柚皮苷处理较对照组显著降低了 β-catenin的蛋白表达。综合这些结果与每一组中的β-catenin mRNA水平结果一致,这表明,柚皮苷治疗增强Wnt/β-catenin信号通路。柚皮苷通过AMPK和Akt信号磷酸化β-catenin通过使用磷β-catenin(ser552)抗体,在对照、10nM柚皮苷、10nM柚皮苷+10nM二氢脱氧吗啡和10nM柚皮苷+ 200 nM Aakti-1/2不同作用下,我们研究了UMR-106细胞中磷β-catenin(ser552)蛋白的表达。柚皮苷较对照组显著增加β-catenin Ser552磷酸化。增加的Akti-1/2或二氢脱氧吗啡减少了 β-catenin Ser552磷酸化。与对照相比,柚皮苷+ Akti-1/2和柚皮苷+二氢脱氧吗啡显著诱导β-catenin Ser552磷酸化。这些结果表明,柚皮苷和AMPK及Akt相互作用诱导β-cateninser552磷酸化。插入下游Wnt反应元件(WRE)。在柚皮苷治疗、柚皮苷+二氢脱氧吗啡治疗(P<0.001)和柚皮苷+Akti-1/2治疗(P<0.01)后8小时内,与对照组相比,UMR-106细胞LEF/TCF转录活性明显提高(P<0.001)。和柚皮苷单独处理相比,这一结果清楚地表明LEF/TCF转录活性的抑制是由于Akti-1/2(P<0.01)或二氢脱氧吗啡(P<0.001)增加引起的。可以指出,柚皮苷疗24小时后转录活性的增加较8个小时衰减一半,反映了柚皮苷诱导活化的β-catenin通路的半衰期。柚皮苷刺激β-catenin易位柚皮苷治疗的UMR-106细胞显示细胞核内有β-catenin的积累。柚皮苷治疗诱导β-catenin易位,从而可以解释相对于对照的细胞的细胞核,10nM的柚皮苷治疗UMR-106细胞核中β-catenin表达相对增加。在Akti-1/2或二氢脱氧吗啡与柚皮苷联合应用时候,β-catenin易位受到压抑,提示柚皮苷能够通过和AMPK和Akt信号通路的相互作用影响β-catenin的调节。柚皮苷可促进小鼠骨骼发育测量后将小鼠5毫克/公斤/天柚皮苷作为本研究的进一步实验采用剂量。实验鼠行假手术作为对照或行OVX以诱发骨丢失。经2周后恢复,OVX小鼠随机分为三组,OVX溶剂组,OVX柚皮苷组和OVX甲状旁腺激素(PTH)组。我们发现和假手术溶剂组小鼠相比OVX小鼠ALP活性明显降低(P<0.05),而柚皮苷和PTH治疗显著恢复OVX小鼠ALP的活性。此外,用BrdU检测Sham假手术组和OVX小鼠细胞增殖。OVX较假手术组小鼠明显减少卵巢细胞增殖(P<0.001)。和OVX溶剂小鼠相比较,OVX小鼠的柚皮苷或PTH治疗能显著提高细胞增殖。这些结果表明,柚皮甙对骨发育有保护作用。与假手术组小鼠相比,OVX组股骨远端、胫骨近端和腰椎L区总骨密度显著降低,表明OVX小鼠模型可以模拟骨质疏松。和OVX溶剂小鼠相比,5毫克/公斤/天的柚皮苷治疗显著地在各个部位提高OVX小鼠总体骨密度及骨小梁骨密度。然而,二氢脱氧吗啡和akti-1/2减少了柚皮苷对总的和骨小梁骨密度的效果。和假手术组小鼠相比,显示OVX小鼠总的与骨小梁横截面积在所有三个部位明显减少,而5毫克/公斤/天柚皮苷显著逆转这些下降。与柚皮苷OVX小鼠比较,二氢脱氧吗啡治疗OVX柚皮苷小鼠在股骨远端和胫骨近端总截面积、以及在胫骨近端骨小梁的横截面面积显著减少。和OVX柚皮苷小鼠相比,Akti-1/2处理OVX柚皮苷小鼠只在胫骨近端骨小梁的横截面面积显著降低。SSI即由pQCT确定的骨强度。和假手术组小鼠相比,OVX小鼠SSI在三部位明显减弱,而柚皮苷治疗明显提高OVX小鼠SSI。二氢脱氧吗啡在股骨远端及胫骨近端对SSI有显著的负向影响,而akti-1/2显著降低OVX柚皮苷小鼠胫骨近端SSI。这些结果表明在骨发育中柚皮苷的积极影响并证实柚皮苷参与体内AMPK和Akt信号通路。在股骨远端骨、胫骨近端和腰椎L-1测量对照组和OVX小鼠骨的刚度。测量的OVX骨刚度在所有的三个部位都减少。柚皮苷恢复了OVX小鼠丢失的骨刚度。由二氢脱氧吗啡或akti-1/2处理OVX柚皮苷小鼠骨的骨刚度下降进一步支持柚皮苷和AMPK和Akt信号相关性。结论柚皮苷的作用包括募集AMPK和Akt信号。在本研究中,我们证实柚皮苷治疗对骨发育的保护作用。我们的研究结果表明,柚皮苷在Ser552残基位置上促进β-catenin磷酸化,稳定β-catenin和导致β-catenin易位进入细胞核。为了理解柚皮苷的机制途径,应该考虑柚皮苷和AMPK及Akt之间的功能关系。最后,我们目前的研究支持柚皮苷作为一个治疗骨质疏松症潜在的治疗剂。