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新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种高度接触性、高死亡的禽类传染病,是危害养禽业的重要疫病。随着近几年基因Ⅶ型毒株的流行,使用传统灭活苗和弱毒苗往往不能取得理想的免疫效果。因此,开展新城疫基因工程疫苗的研究具有重要的意义。DNA疫苗被称为“第三代疫苗”,能够刺激机体同时产生体液免疫和细胞免疫反应,而且持续时间长,是最具有潜力的基因工程苗之一。为了深入研究新城疫DNA疫苗,本研究利用含β-actin启动子和CMV增强子的载体质粒pCAGGS成功构建了真核表达质粒pCAG-F和pCAG-IL12,通过电穿孔导入的方式将质粒输送到动物体内,研究电穿孔免疫方式和鸡IL12重组表达质粒共免疫方式对pCAG-F DNA疫苗免疫原性的增强作用。首先,以基因Ⅶ型新城疫病毒CHICKEN/CH/GD/GM-03作为F基因的供体,在上游引入Kozak序列,构建出pCAG-F真核表达质粒,分别以电穿孔或者普通肌肉注射的方式免疫SPF鸡群,通过检测机体的体液免疫和细胞免疫应答水平,综合评价电穿孔技术对新城疫DNA疫苗免疫原性的增强作用,并通过免疫保护试验对疫苗效果进行评估。血清抗体中和试验结果显示:在二免后2周pCAG-F/EP组的针对NDV GM株的中和抗体滴度高于pCAG-F/IM组。MTT法检测免疫鸡外周血T淋巴细胞增殖试验,结果显示:pCAG-F/IM组和EP组T淋巴细胞对CoA的刺激均有明显的反应性。二免后14 d,pCAG-F/IM组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异显著(P<0.05),而EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P<0.001)。试验结果表明电穿孔的免疫方式能够显著增强新城疫F基因DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫应答水平。二免后14 d进行新城疫病毒强毒攻击,pCAG-F/IM组存活率为90%,表明F基因作为新城疫基因的免疫原基因具有可行性。pCAG-F/EP组存活率为100%,说明电穿孔的免疫方式能够增强pCAG-F的攻毒保护效果。拭子病毒分离的结果表明,电穿孔的免疫方式能够降低排毒率和缩短排毒时长。其次,构建表达鸡源IL-12的真核表达质粒,在电穿孔技术的基础上,进一步探讨分子佐剂IL-12对新城疫F基因DNA疫苗的免疫增强作用。血清中和抗体试验结果显示:在三免后2周pCAG-F+pCAG-IL12/EP组和pCAG-F/EP组相比,中和抗体差异极显著(P<0.01)。MTT法检测免疫鸡外周血T淋巴细胞增殖试验,结果显示:二免后14 d,pCAG-F/EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P<0.01),pCAG-F+pCAG-IL12/EP组T细胞CoA刺激的OD值和对照组相比差异极显著(P<0.001)。pCAG-F+pCAG-IL12/EP组和pCAG-F/EP组相比T细胞CoA刺激的OD值差异显著(P<0.05)。结果表明,pCAG-IL12质粒能够增强新城疫重组DNA疫苗pCAG-F的体液和细胞免疫应答。拭子病毒分离的结果表明,pCAG-F+pCAG-IL12/EP组仅第3 d时,有1只鸡(1/10)喉头可分离到病毒,这说明共免疫pCAG-IL12对重组DNA疫苗pCAG-F具有较明显的免疫增强作用,能够有效地抑制病毒在机体内的复制和排毒。综上,本研究制备了新城疫病毒F基因DNA疫苗,并评估了电穿孔基因导入技术和使用pCAG-IL12质粒作为佐剂均对新城疫pCAG-F DNA疫苗的免疫效果的影响,为新一代新城疫DNA疫苗的研制提供了新的思路和方向。