miRNA是一类长度为19~23 nt的内源性非编码单链RNA分子,可通过降解靶mRNA或阻断靶mRNA的翻译来实现转录后调控作用。鼠或人胚胎干细胞中存在特异性高表达的miRNA,并在维持其多能性的过程中发挥重要调控作用,而鸡胚胎干细胞中miRNA的研究则相对较少。为此,本试验以鸡胚成纤维细胞为对照,利用miRNA表达谱芯片筛选了鸡胚胎干细胞中特异性高表达的miRNA,并利用实时荧光定量PCR法对芯片结果进行验证;在此基础上,通过生物信息学软件预测候选miRNA的靶基因,荧光定量PCR检测胚盘细胞与鸡胚成纤维细胞中候选miRNA靶基因的表达水平;最后,通过双荧光素酶检测系统进一步验证筛选的基因是否为miRNA的靶基因。结果显示:1.利用miRNA表达谱芯片在cESCs中检测到18条高水平表达的miRNA(P<0.05),其中,gga-miR-1777、gga-miR-302d和gga-miR-1599的表达水平分别是CEFs的24.43、210.81及25.37倍。2.cBDCs中gga-miR-1777、gga-miR-302d和gga-miR-1999的表达水平分别是CEFs中的232.90%、439.73%、183.47%(P<0.01),其表达规律与芯片结果一致。3.以cBDCs 0 h作对照,gga-miR-1777在HH2期、HH3期中的表达量分别下调7%、21%;gga-miR-302d在HH2期、HH3期中的表达量分别下调24%、44%(P<0.01)。4.利用数据库TargetScan和miRDB预测gga-miR-1777和gga-miR-302d的潜在靶基因,选取Atxn1和Wdr1分别作为gga-miR-1777和gga-miR-302d的候选靶基因。5.cBDCs中Atxn1及Wdr1的表达水平分别是CEFs的64.05%及57.53%,均极显著下调(P<0.01),初步提示Atxn1及Wdr1分别是gga-miR-1777及gga-miR-302d的靶基因。6.分别构建Wdr1和Atxn1的野生型及突变型3’UTR双荧光素酶报告载体,与gga-miR-302d mimics或gga-miR-1777 mimics共转染293T细胞,检测各组荧光值,结果显示:gga-miR-302d mimics对Wdr1野生型的报告荧光上调14%,对Wdr1突变型的报告荧光下调31%(P?0.05);而gga-miR-1777 mimics对Atxn1野生型的报告荧光上调11%,对Atxn1突变型的报告荧光上调19%。提示gga-miR-302d可通过与Wdr1基因的3’UTR端结合下调其表达,而gga-miR-1777很可能与Atxn1基因的3’UTR端无明显相互作用。上述结果表明,在鸡胚胎干细胞中高水平表达的gga-miR-302d,可能通过抑制促分化基因Wdr1的表达,在维持鸡胚胎干细胞多能性过程中发挥重要调控作用。