目的:由软骨细胞产生的基质降解酶MMP9和血管内皮生长因子(VEGFA)是颞下颂关节骨关节炎(TMJOA)发病过程中软骨破坏必不可少的效应分子。同时TMJOA发病时的关节软骨中出现新生血管以及滑膜等结构血管新生增加也离不开VEGFA的表达上调。骨关节炎(OA)中炎症与血管化往往存在着相互促进的关系。白介素-6(IL6)是TMJOA病程进展中最为关键的炎症因子之一,相关的信号通路—ERK1/2及其下游转录因子的作用仍未完全阐明。本课题的主要目的是验证IL6—ERK1/2信号通路下游的关键转录因子—雌激素相关受体Y(ERRγ)在大鼠髁突软骨细胞中通过调控下游相关因子进而导致细胞外基质降解及血管化,并详细讨论IL6-MAPK/ERK-ERRγ-MMP9/VEGFA信号轴对大鼠TMJOA发生发展的影响。方法:TMJOA体外模型构建:三周龄Wistar大鼠注射处死后进行解剖,从双侧颞下颂关节中取出髁突软骨,将髁突软骨切成1mm3大小的组织块,采用II型胶原酶消化法得到原代髁突软骨细胞,通过观察细胞的形态、阿利新蓝染色法鉴定软骨培养结果。将培养至第1代髁突软骨细胞(P1代)随机分成两个大组:浓度梯度组和时间梯度组。浓度梯度组分为5个小组:分别用Ong/ml、5ng/ml、1Ong/ml、20ng/ml、40ng/ml浓度的IL6处理24小时。时间梯度组分为7个小组使用20ng/ml的IL6刺激0.5h、1h、3h、6h、12h、24h和48h。通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测 ERRY、ERRα、HIF-1α、MMP9/13、VEGFA、COL2 和 AGG的mRNA的表达变化,确定建模的所用IL6的最佳刺激浓度和刺激时间。通过Western blot检测相关通路蛋白及表型蛋白的表达以及通过免疫荧光染色法鉴定IL6刺激后的软骨细胞相关表型蛋白,确定建模成功与否。表达调控验证:应用ERK-cDNA质粒及ERK-siRNA分别转染P1代细胞,通过Western blot观察下游ERRy、ERRα、MMP9、VEGFA的表达。将不同浓度的ERK特异性抑制剂U0126加入到体外TMJOA模型的软骨细胞培养基中,通过定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot检测相关的通路蛋白Total-ERK、P-ERK、ERRγ的表达以及下游相关表型蛋白MMP9、VEGFA的表达。应用ERRγ-cDNA质粒及ERRγ-siRNA分别转染P1代细胞,通过Western blot观察下游MMP9、VEGFA、COL-2和AGG的表达;通过阿利新蓝染色观察ERRy敲除或过表达对于软骨细胞形态及分化的影响。将ERRy特异性抑制剂GSK5182以及U0126分组加入到体外TMJOA模型的软骨细胞培养基中,通过免疫荧光标记法检测 ERRγ 的表达。通过将 U0126、GSK5182、ERRα-siRNA、ERRy-siRNA、HIFlα-siRNA同时刺激或转染软骨细胞,通过阿利新蓝染色法观察软骨细胞的形态特征,及通过 Western blot 检测 MMP3、MMP9、MMP13、VEGFA、COL2、AGG的表达变化,以验证GSK5182和U0126对TMJOA的治疗作用。将P1代软骨细胞分为两组:对照组(Ong/ml,12h,IL6)以及OA组(20ng/ml,12h,IL6)。加药刺激12h后甲醛固定,甘氨酸中和后收集细胞,通过染色质免疫共沉淀(Ch-IP)技术验证ERR γ是否直接调节MMP9及VEGFA的表达。血管新生抑制实验共分为四组:DMSO 组、IL6+DMSO 组、IL6+U0126 组、IL6+GSK5182组(抑制剂使用DMSO稀释)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验验证四组试剂对血管新生的影响。结果:(1)大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞成功提取并培养后,显微镜下观察可见正常体外软骨细胞形态呈规则的小圆形。孵育24h后,软骨细胞大部分贴壁成功,显微镜下观察可见细胞形态呈多边形或星形;软骨细胞培养4-5天后,镜下可观察到细胞呈“铺路石”样排列。一次传代之后,贴壁细胞生长的速度加快;通过阿利新蓝染色,发现髁突软骨细胞细胞质呈淡蓝色,从第三代(P3)开始离体培养的软骨细胞开始出现去分化状态,即细胞呈四边形且胞质深染,呈纤维状延伸,增殖能力下降。RT-qPCR结果表明:随着IL6浓度的改变以及刺激时间的改变,髁突软骨细胞中ERRγ、HIFlα、MMP9/13、VEGFA、COL2和AGG的表达均出现不同程度的改变,在IL6浓度为20ng/ml时,对髁突软骨细胞的COL2和AGG的表达下降达到最大值,而MMP9/13、VEGFA表达上调达到最大值。经过IL6(20 ng/mL)诱导的髁突软骨细胞中ERRY的表达显著上调;而ERRα、HIF-1α表达改变则不具备统计学意义。Western blot结果表明TMJOA体外模型建模成功。通过同时标记MMP9及COL2免疫荧光结果显示:IL6(20 ng/mL)刺激12h即可构建TMJOA体外模型。(2)使用U0126抑制ERK的磷酸化后,Western结果显示下游的ERR Y以及MMP9、VEGFA表达均明显下调,ERRα的表达无统计差异。ERR γ cDNA质粒转染P1代软骨细胞后的Western印迹显示MMP9及VEGFA表达明显上调,COL2、AGG表达降低;而ERRy-siRNA对TMJOA体外模型软骨细胞的炎症有明显抑制作用,Western印迹显示MMP9及VEGFA表达明显下调,COL2、AGG表达稍有恢复。GSK5182、U0126两种特异性抑制剂加入TMJOA体外模型软骨细胞中后,免疫荧光结果及Western印迹显示:MMP3/9/13、VEGFA表达明显受到抑制,COL2及AGG表达上调;阿利新蓝染色结果显示,OA组大部分细胞细胞质呈深蓝色而对照组和抑制剂组大部分软骨细胞细胞质呈淡蓝色。ERR Y反应序列为:TCAAGGTCA。Ch-IP结果显示:ERR γ于Mmp9启动子位点ERRE#2(-65 to-48)处激活基因转录;于Vegfa启动子位点ERRE#1(-107 to-92)处激活基因转录;RT-qPCR结果显示MMP9及VEGFA表达较CON组和IGg组表达明显上调。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验结果显示:光镜下可见IL6+DMSO组血管网最为丰富,而IL6+U0126组和IL6+GSK5182组血管网较稀疏。结论:ERRγ作为一种孤儿核受体,是炎症发生发展的一个重要转录因子。本实验从表观遗传学层面为IL6结合受体gp130后激活下游P-ERK进而上调MMP9和VEGFA这一通路作出了完善,而ERR γ就是这条路上那“缺失的一环”。TMJOA中ERR γ能够直接调控MMP9及VEGFA的转录,为TMJOA的发生发展机制提供了潜在的研究方向。特异性抑制剂GSK5182和U0126对TMJOA有一定治疗作用,同时能够抑制血管新生。抑制血管新生是目前骨关节炎研究和肿瘤研究的一大方向,GSK5182作为新兴药物对肿瘤的作用也亟需进一步探究。