第一部分：肿瘤血管破坏剂DMXAA的抗血小板、抗血栓作用及其机制随着我国人民生活水平的提高,动脉血栓性疾病如冠心病和中风等已超过恶性肿瘤成为导致国人死亡的首要疾病。血小板功能亢进或异常激活引起的血管内血栓形成是此类疾病的病理基础,抗血小板药对其治疗效果是肯定的。目前临床上使用的抗血小板药主要有环氧化酶抑制剂阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂西洛他唑、和整合素allbβ3受体拮抗剂阿昔单抗等,但由于存在阿司匹林抵抗和氯吡格雷抵抗等现象,导致现有的抗血小板药对某些血栓性疾病患者临床应用受限,部分患者治疗效果未尽如人意。因此,临床仍需要抗血小板作用更强且副作用更小的药物面世以改善某些动脉血栓性疾病患者的疗效,研究开发此类药物仍具有较大的市场。DMXAA作为肿瘤血管破坏剂治疗非小细胞肺癌等已进入Ⅲ期临床试验,其主要通过破坏肿瘤组织血管导致肿瘤组织血供减少,从而达到抑制肿瘤作用。FAA结构与DMXAA类似,显著抑制小鼠来源肿瘤,但其作为肿瘤血管破坏剂进入临床试验发现其几乎不抑制人来源肿瘤。在临床试验中发现患者使用FAA治疗时有明显出血,进一步研究发现其具有抗血小板、抗血栓作用。虽然,临床试验中使用DMXAA治疗的患者未见明显出血,其是否具有抗血小板、抗血栓作用也未见报道,但由于DMXAA与FAA结构类似,均属于黄酮类药物,我们推测其具有与FAA类似的抗血小板、抗血栓作用。因此,在本研究中,我们探讨DMXAA是否具有抗血小板、抗血栓作用,及其相应机制。在本研究中,我们发现DMXAA在10-600μmol/L范围内浓度依赖性地抑制TXA2类似物U46619诱导的阿司匹林处理或未处理的人血小板聚集和ATP释放。300 μmol/L DMXAA强烈抑制AA、ADP、胶原或瑞斯托酶素诱导的阿司匹林未处理的人血小板聚集和ATP释放。通过给小鼠尾静脉注射DMXAA,体外取血检测发现DMXAA也抑制U46619、AA、胶原或瑞斯托霉素诱导的小鼠血小板聚集。机制研究发现DMXAA主要通过抑制血栓素合成酶导致血小板TXA2生成抑制,进而抑制TXA2信号调控下游的Akt和Erk1/2蛋白磷酸化。另外,我们发现DMXAA也抑制血小板内PDE。最后,我们采用FeCl3诱导的小鼠肠系膜动脉血栓模型和激光诱导的小鼠提睾肌动脉血栓模型均发现DMXAA静脉注射给药显著抑制体内血栓形成。在与氯吡格雷口服给药相同的抗血栓作用剂量下,DMXAA静脉注射给药小鼠未见明显出血。综上所述,在本研究中我们首次发现DMXAA具有强大的抗血小板、抗血栓作用,且没有明显的出血副作用,其抗血小板作用机制为抑制血栓素合成酶导致血小板TXA2生成抑制和PDE抑制导致血小板内cAMP和cGMP水平升高。DMXAA已经在临床前期试验和Ⅰ期临床试验中显示药物安全性好,因此有希望作为一个有效和安全的抗血小板药物推向市场。第二部分：NOD2增强血小板活化和血栓形成的作用及其机制血小板的主要功能是参与生理性止血和病理性血栓,其功能亢进或异常激活可导致冠心病、中风等动脉血栓性疾病发生,在此过程中血小板表达的各种信号分子可显著影响其活化过程。NOD (nucleotide binding oligomerization domain)作为白细胞中的众多模式识别受体之一,包括NOD1和NOD2,其在机体对抗微生物入侵的天然免疫系统中发挥重要作用。我们课题组前期研究已经发现人和小鼠血小板表达NOD2,但不表达NOD1, MDP腹腔注射激活NOD2可增强野生型小鼠血小板对ADP、凝血酶或胶原诱导的血小板聚集和ATP释放,增强凝血酶诱导的野生型小鼠血小板凝块收缩反应,但几乎不影响凝血酶诱导的NOD2基因敲除小鼠血小板凝块收缩反应,说明NOD2在小鼠血小板活化过程中可能发挥作用,但对人血小板活化、体内血栓形成的影响及相应机制等尚未阐明。在本部分中我们研究了采用MDP激活NOD2对人血小板活化、体内血栓形成的影响及增强血小板活化的分子机制。我们发现MDP通过使血小板内NOD2单体变成二聚体从而激活NOD2。体外MDP激活NOD2浓度依赖性地增强凝血酶或胶原诱导的人血小板聚集和ATP释放。体外MDP激活NOD2增强凝血酶诱导的人血小板凝块收缩反应,但几乎不影响血小板在固相纤维蛋白原上铺展。给FeCl3诱导的小鼠肠系膜动脉血栓模型小鼠腹腔内注射MDP激活NOD2,显示MDP可增强FeCl3诱导的野生型小鼠肠系膜动脉血栓形成,但几乎不影响FeCl3诱导的NOD2基因敲除小鼠肠系膜动脉血栓形成。采用抗血小板血清去除小鼠体内血小板,再输入MDP刺激或未刺激的血小板,最后尾静脉注射胶原和肾上腺素诱导的肺栓塞模型小鼠观察小鼠死亡情况,结果显示输注MDP刺激的野生型小鼠血小板可导致小鼠肺栓塞死亡率增高,而输注MDP刺激的NOD2基因敲除小鼠血小板对小鼠肺栓塞死亡率几乎不影响,说明MDP激活血小板NOD2可导致小鼠肺栓塞死亡率增高,进一步说明MDP激活NOD2增强体内血栓形成主要是通过激活血小板NOD2。小鼠断尾出血量检测显示MDP激活NOD2可使野生型小鼠出血量减少,而在NOD2基因敲除小鼠中则无此作用,说明MDP激活血小板NOD2也加速了血小板依赖的止血。进一步研究机制,首次发现血小板表达受体相互作用蛋白-2 (receptor-interacting protein 2, RIP2), MDP激活血小板NOD2导致RIP2磷酸化增加,进一步激活RIP2调控的下游MAPK信号通路和cGMP/PKG通路,从而发挥NOD2激活增强血小板活化的作用。综上所述,本部分研究揭示了MDP激活NOD2增强人血小板活化和体内血栓形成,并阐明了相应的分子机制,其主要是激活下游调控的RIP2/MAPKs通路和RIP2/cGMP/PKG通路发挥作用,这较好地解释了一些炎症患者如克罗恩氏病(Crohn’s disease)等为何易发动脉血栓性疾病,为治疗此类患者易发的动脉血栓性疾病提供了理论基础和实验依据。