研究背景:视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）是一种慢性进行性遗传性视网膜疾病。近年来炎症在RP中的作用受到重视。RP的微炎症反应不仅发生在视网膜,在房水和玻璃体液、甚至外周血中炎症因子都有升高,这提示RP眼内及全身存在慢性持续性微炎症反应,但微炎症的来源尚不清楚。视网膜小胶质细胞的激活促进RP神经性炎症反应及光感受器细胞的凋亡,在RP进展中发挥重要作用。激活态小胶质细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）在脑内可促进微炎症播散,鉴于此,我们推测RP不仅存在视网膜微炎症反应,激活的小胶质细胞可能通过EVs传递炎症信息,维持眼内微炎症,并作用于远离视网膜的晶状体和巩膜,参与眼内并发症的形成,同时引起系统性微炎症反应,表现为外周血中性粒细胞数与淋巴细胞数的比值（neutrophil count to lymphocyte count ratio,NLR）升高。研究目的:探究RP并发白内障患者眼部临床表现与外周血炎症标志物NLR的相关性,并在RP小鼠上验证眼内及全身微炎症反应的存在,阐明RP视网膜小胶质细胞分泌的EVs是维持眼内及全身微炎症环境的原因,并探讨它引起眼内组织变化的机制。研究方法:一、外周血NLR与RP并发白内障临床表现的相关性分析收集2008.1.1-2018.6.1就诊于我院眼科并住院行白内障超声乳化联合人工晶状体植入手术的RP并发白内障患者,以及年龄、性别相匹配的年龄相关白内障（age-related cataract,ARC）患者的住院病历资料。比较两组患者白内障类型、眼轴长、悬韧带状况、视网膜厚度、NLR值等的差异,分析RP并发白内障临床表现与NLR的相关性,评价NLR在预测RP某些临床表现的准确性、敏感性和特异性。二、激活态小胶质细胞分泌的EVs介导RP眼内及系统性微炎症反应（1）观察体内、外小胶质细胞的激活及炎症反应用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小胶质细胞BV2,在倒置显微镜下观察细胞形态变化;用视网膜组织石蜡切片观察不同年龄RP模型小鼠Rd/b6和正常C57小鼠的视网膜厚度变化,用Iba1染色观察小胶质细胞的激活状态及在视网膜中的分布变化;在视网膜铺片上行CD68染色,观察小胶质细胞的激活情况;用视网膜电流图（electroretinogram,ERG）评价视网膜的功能;用Western blot、RT-qPCR、细胞免疫荧光染色等方法检测BV2细胞以及视网膜中炎症因子（IL-1、IL-6、CCL-2、TNF-α、iNOS、IL-8）及炎症相关 miRNA（miR-155-5p,miR-146a-5p,miR-21a-5p）的表达变化。（2）观察Rd/b6小鼠眼内及系统性微炎症反应及其对眼组织的影响用Western blot检测Rd/b6小鼠、C57小鼠房水中炎症因子、巩膜中Collagen I和MMP-2、晶状体中EMT标志蛋白（E-cadherin,α-SMA,Fibronectin）的表达变化。用晶状体石蜡切片进行细胞核染色,观察晶状体上皮细胞的分布变化;用ELISA检测小鼠外周血IL-6、IL-8和CCL-2的表达水平;通过全血细胞计数检测血液NLR值。（3）观察体内、外激活态小胶质细胞分泌的EVs的促炎作用用LPS（+）和LPS（-）的完全培养基培养BV2细胞,获得激活态小胶质细胞分泌的EVs（LPS-EVs）和静息态小胶质细胞分泌的EVs（Control-EVs）,用RT-qPCR检测EVs中炎性介质的表达;将EVs与BV2细胞共培养24h后,检测BV2细胞中炎性介质及Iba1的表达。用LPS-EVs进行Rd/b6和C57小鼠玻璃体腔注射,在视网膜铺片上行Iba1和CD68免疫荧光染色,观察小胶质细胞激活情况;用Western blot和RT-qPCR检测视网膜中炎性介质和Iba1、巩膜中Collagen Ⅰ和MMP-2及晶状体中EMT标志物的表达;比较注射前和注射后1周小鼠外周血NLR值的变化。三、RP视网膜中激活态小胶质细胞分泌的EVs介导晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）发生EMT的作用及机制研究（1）观察EVs被LECs摄取及在眼内转移将PKH26标记的LPS-EVs与LECs共培养24h,在共聚焦显微镜下观察EVs在细胞内的分布;Rd/b6小鼠玻璃体腔注射DiR标记的EVs,48h后行小动物活体成像,观察在体和离体眼内EVs的分布。（2）观察LPS-EVs对LECs发生EMT的作用分别用 LPS-EVs 和 Control-EVs刺激小鼠 LECs 24h,用 Western blot 和 RT-qPCR检测LECs中EMT标志物、TGF-β 1/Smad信号通路蛋白（TGF-β 1,Smad2和Smad3）的表达;用细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移能力。（3）观察LPS-EVs中miR-155-5p对LECs发生EMT的作用分别用 miR-155-5p inhibitor 和 miR-155-5p mimics 转染 LPS 刺激的 BV2 细胞,以敲低或过表达LPS-EVs中miR-155-5p,并与LECs共孵育,用三（2）中的方法进行相同实验。研究结果:一、NLR与RP并发白内障患者临床表现的相关性分析RP组和ARC组白内障的类型分布有显著差异（P＜0.001）,RP组以后囊膜下型白内障（posterior subcapsular cataract,PSC）为主,而ARC组以皮质性白内障为主。虽然两组患者眼轴长分布无明显差异（P=0.235）,但RP组超长眼轴（AL＞30 mm）者占比高于ARC组。RP组比ARC组更易发生悬韧带薄弱,且RP患者长眼轴者较正常眼轴者更易发生悬韧带薄弱。RP组患者视网膜萎缩变薄,外界膜、嵌合体带和椭圆体带连续性中断的发生率显著高于ARC组（P＜0.001）。RP 组 NLR 值（1.93±0.83）明显高于 ARC 组（1.65±0.59,P=0.029）。NLR 值随着PSC混浊程度的增加（组间P＜0.05）、悬韧带薄弱程度的加重（组间P＜0.05）、最佳矫正视力的下降（P=0.048）而升高;NLR值与视野平均变异参数（r=-0.356,P=0.049）和加权视野指数（r=-0.772,P=0.005）显著相关,而与模型标准变异参数无相关性（r=-0.206,P=0.266）。NLR值≥1.36可预测混浊程度＞Ⅰ级（P1,混浊面积＞3%）的PSC（P=0.002,95%CI,0.672-0.934）;NLR值≥2.12可预测RP并发白内障患者存在悬韧带薄弱（P=0.002,95%CI,0.665-0.928）;NLR 值≥1.51 可以作为判断 BCVA 是否较好的辅助手段（P=0.015,95%CI,0.540-0.793）。二、激活态小胶质细胞分泌的EVs介导RP眼内及系统微炎症反应（1）体内、外小胶质细胞的激活及炎症反应LPS刺激的小胶质细胞BV2的炎症因子:IL-1、IL-6、CCL-2、TNF-α、iNOS、IL-8,炎症相关 miRNA:miR-155-5p,miR-146a-5p,miR-21a-5p,以及 Iba1 的表达明显高于静息态BV2。各年龄段Rd/b6小鼠视网膜内上述炎症因子及Iba1的表达量高于同龄C57小鼠。出生14天时Rd/b6小鼠视网膜中可见Iba1阳性的小胶质细胞迁移至外层视网膜,CD68阳性的小胶质细胞数量最多;21天时外层视网膜小胶质数量减少,CD68阳性小胶质细胞数量下降并维持稳定。Rd/b6小鼠视网膜厚度随鼠龄的增长逐渐变薄（均为P＜0.001）,出生14天后未记录到明显的ERG波形。（2）Rd/b6小鼠眼内及系统性微炎症反应及其对眼组织的影响与C57小鼠相比,Rd/b6小鼠房水中IL-1β、IL-6、CCL-2、TNF-α和IL-8的表达明显升高;巩膜中Collagen Ⅰ的表达下降（P＜0.05）,而MMP-2的水平升高（P＜0.01）;晶状体中 E-cadherin 的表达降低（P＜0.001）,而 α-SMA（P＜0.01）和 Fibronectin（P＜0.001）的表达增高。Rd/b6小鼠的LECs极性消失,细胞间紧密连接中断,后囊膜下出现大量有核细胞。Rd/b6小鼠外周血的IL-8,IL-6,CCL-2水平升高（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001）,NLR值也明显高于C57 小鼠（P＜0.001）。（3）体内、外激活态小胶质细胞分泌的EVs的促炎症作用LPS-EVs中上述炎症介质的表达量高于Control-EVs。用LPS-EVs处理小胶质细胞BV2后,细胞中炎性介质及Iba1的表达明显高于空白对照组和Control-EVs处理组,而且miR-155-5p的升高最显著（P＜0.001）。在C57小鼠和Rd/b6小鼠的右眼玻璃体腔注射LPS-EVs后,两组小鼠视网膜中Iba1和CD68阳性的小胶质细胞数量增加,IL-1β、IL-8及Iba1的蛋白表达量增加;巩膜中Collagen Ⅰ的表达均下调,MMP-2的表达明显升高;晶状体中Fibronectin和α-SMA蛋白的表达明显升高,而E-cadherin明显下降。外周血的NLR值均较注射LPS-EVs前明显升高,而且Rd/b6小鼠的NLR值均明显高于C57小鼠。三、RP视网膜中激活态小胶质细胞分泌的EVs介导LECs发生EMT的作用及机制研究（1）LPS-EVs被LECs摄取、在眼内转移PKH26标记的LPS-EVs可转入LECs内,分布于细胞核周围。DiR标记的EVs可从C57小鼠和Rd/b6小鼠玻璃体腔转移入前房。（2）LPS-EVs对LECs发生EMT的作用LPS-EVs处理的LECs中E-cadherin表达下降,而α-SMA和Fibronectin的表达增高,LECs迁移能力增强;TGF-β1,Smad2和p-Smad2的蛋白表达上调。（3）LPS-EVs 中 miR-155-5p 对 LECs 发生 EMT 的影响用 miR-155-5p mimics 上调 LPS-EVs 中 miR-155-5p 可进一步地抑制 LECs 中E-cadherin的表达、促进α-SMA和Fibronectin的表达以及增强细胞的迁移能力;上调 TGF-β1,Smad2 和 p-Smad2 的蛋白表达;而用 miR-155-5p inhibitor下调 LPS-EVs中miR-155-5p可以逆转LECs的上述变化。结论:RP并发白内障患者眼部临床表现的严重程度与系统性微炎症反应密切相关,全血NLR值可预测RP的一些临床表现及其严重程度;RP小鼠视网膜内、眼内以及全身存在微炎症反应,视网膜内激活态小胶质细胞分泌的包含炎性介质的EVs是传递和维持眼内以及系统性微炎症反应的重要物质,EVs作用于远离视网膜的晶状体和巩膜,诱导LECs发生EMT及巩膜胶原的降解,参与RP眼部并发症的形成。