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哺乳动物长期暴露于高原环境中,习服不良,易在低氧刺激下产生以红细胞增多症为代表的高原病,这也是常驻高原人群中最为常见的慢性疾病。世居高原的牦牛(Bos grunniens)是高海拔低氧环境中的特有牛种,主要生活于海拔3000-5000米之间,其对低氧环境适应良好,虽有红细胞数量随着海拔升高而升高的生理性变化,但未出现红细胞增多症这一代表性高原疾病。在人和小鼠的研究中已发现,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)作为红细胞生成调控的核心因子,在常氧和低氧条件下均受低氧诱导因子-2α(hypoxia induced factor-2α,HIF-2α)的调控;且其在造血功能之外,在低氧刺激下还表现出多种组织保护作用。但截止目前,牦牛中EPO的表达特征及其调控机制还未见研究和报道。因此,本试验首先对成年牦牛心脏、肝脏、肺脏和肾脏中EPO、HIF-1α和HIF-2α的表达情况进行检测,而后,以其主要生成器官——肾脏为核心,对其EPO生成细胞及表达调控进行研究,具体结果如下:1.试验使用qRT-PCR和免疫组织化学方法,对成年牦牛心脏、肝脏、肺脏和肾脏中EPO、HIF-1α和HIF-2α的mRNA和蛋白表达情况进行检测,结果表明:EPO、HIF-1α和HIF-2α广泛表达于上述组织,但其mRNA表达量与蛋白表达强度不尽一致。肾脏中EPO mRNA表达量相对较高,免疫组化结果显示,其阳性表达主要位于肾内集合管上皮细胞,肾小管上皮细胞和肾间质成纤维样细胞中,HIF-1α和HIF-2α在肾内与EPO均有共表达位置,这与人和鼠的研究结果一致,提示牦牛EPO的生成调控也可能与HIF-1α或HIF-2α有关。除肾脏外,肺脏和心脏中EPO、HIF-1α和HIF-2α的阳性表达,显示了EPO在低氧条件下的组织保护作用。2.试验用不同方法对牦牛肾小管上皮细胞(renal tubule epithelial cells,RTECs)和肾间质成纤维样细胞(renal interstitial fibroblast-like cells,RIFs)进行分离培养,结果显示,同时加入1 mg/mL I型胶原酶和1 mg/mL II型胶原酶的消化方法,可在最短的时间内得到数量最多、生长状态良好、增殖能力强的原代细胞。在用差速消化法对细胞进行纯化后,鉴定结果显示,纯化后的RTECs呈典型的铺路石样,角蛋白18表达阳性,波形蛋白和血小板-内皮细胞粘附分子表达阴性,这些形态和生化特征与人和小鼠的肾小管上皮细胞一致。RIFs呈纺锤形或不规则的三角形,波形蛋白呈阳性表达,角蛋白18和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)呈阴性表达。上述结果表明,试验分离得到的牦牛RTECs和RIFs具有典型的肾小管上皮细胞和肾间质成纤维样细胞的形态和生化特征。3.为检测牦牛RTECs与RIFs的EPO生成能力,试验在细胞中添加了不同浓度的DMOG,其可抑制脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylase domain,PHD)对HIF的降解,使HIF-1α和HIF-2α表达量升高,从而模拟低氧环境。结果显示,随着DMOG浓度的升高,在RTECs中,HIF-1α和HIF-2α的表达量呈现浓度依赖性升高,但各浓度下均未检测到EPO的表达;而RIFs中EPO、HIF-1α和HIF-2α的表达量同步升高。这说明牦牛肾脏中EPO的生成细胞是RIFs,而非RTECs,与此同时,PHD对EPO的生成具有负向调控作用。4.研究使用siRNA干扰的方法,检测HIF-1α和HIF-2α对EPO的调控作用。试验首先对RIFs中HIF-1α的表达进行干扰,结果表明,试验组细胞HIF-1αmRNA表达量显著下降,HIF-1α的表达受到稳定干扰。在对照组和试验组中同步添加200μmol/L DMOG以抑制PHD对HIF的降解,WB结果表明,HIF-1α在DMOG+HIF-1αsiRNA组中的表达量显著低于DMOG组,HIF-2α和EPO在两组中的表达基本一致;使用qRT-PCR对两组细胞中EPO mRNA表达进行了检测,结果显示其表达也并无差异;上述结果表明,RIFs中EPO的表达不受HIF-1α的调控。在HIF-2α表达受到稳定干扰的RIFs中,HIF-2αmRNA的表达显著下降,与此同时,WB结果显示,HIF-1α在DMOG和DMOG+HIF-2αsiRNA组中的表达基本一致,但HIF-2α、EPO和EPO mRNA在DMOG+HIF-2αsiRNA组中的表达量均显著低于DMOG组。这说明RIFs中EPO的表达受HIF-2α的调控,且HIF-2α对EPO的表达有正调控作用。5.为初步探索热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)对EPO的调控作用,试验在RIFs中添加HSP90抑制剂GA,结果显示,随着GA浓度的升高,RIFs中HSP90、HIF-1α、HIF-2α和EPO的表达均同步下降,这意味着本试验初次发现,EPO的生成不仅依赖于PHD的调控,也受HSP90的调控。综上所述,(1)本研究首次对牦牛心脏、肝脏、肺脏和肾脏中EPO、HIF-1α和HIF-2α的表达情况进行检测,EPO、HIF-1α和HIF-2α在牦牛肾小管上皮细胞和肾间质成纤维样细胞中的共表达与人和鼠的一致;三个因子在肺脏和心脏中的表达情况提示了EPO在低氧条件下对组织的保护作用。(2)分离纯化得到的牦牛RTECs和RIFs两种细胞,其形态和生化特征与人和小鼠的基本一致。对两种细胞EPO的生成能力进行研究,结果显示,在添加DMOG模拟的低氧环境中,具有EPO生成能力的细胞是RIFs,而非RTECs。(3)RIFs中PHD对EPO的生成具有负调控作用,这一调控通过HIF-2α完成,而HSP90对EPO的生成有正调控作用。