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关于UV-B辐射对植物造成影响的研究由来已久,根据辐射剂量大小划分,研究方向主要集中在两方面。一方面适宜剂量的UV-B辐射可以作为信号,发挥调控作用,启动植物中以UVR8为识别位点的光形态建成,使植物在形态结构、代谢等各个方面发生严谨有序的变化,从而适应环境中不可避免的UV-B辐射;一方面高剂量UV-B辐射超出植物自身调节的阈值,使植物无法自愈,发生不可恢复的变化,甚至影响植物的遗传物质,造成植物的死亡。染色质组装因子1(Chromatin assembly factor 1,CAF-1)这个保守的组蛋白分子伴侣,在酵母、小鼠、拟南芥(Arabidopsis thaliana)乃至人体广有研究,综合既往研究结果,CAF-l复合体在多个生物学过程发挥重要作用,例如基因转录,DNA复制和修复。但对于CAF-l复合体是否参与增强UV-B胁迫后拟南芥氧化还原损伤乃至DNA损伤的修复还有待探索。本实验室前期自拟南芥资源中心购买了CAF-1复合体的大亚基FAS1突变体Atfas1-4,经鉴定获得纯和突变体。结合增强UV-B辐射对拟南芥损伤的特点及CAF-1复合体的功能,本研究利用现有突变体株系Atfas1-4在增强UV-B辐射下展开研究,为进一步揭示增强UV-B辐射损伤修复机制奠定基础。主要的研究结果如下:(1)三引物法鉴定Atfas1-4为纯合突变体,利用半定量对Atfas1-4突变体中FAS1表达量进行测定,FAS1含量显著减少,说明Atfas1-4突变体内FAS1的功能缺失;(2)对Atfas1-4突变体的表型进行观测,FAS1的功能缺失使拟南芥种子育性降低;与野生型(Wild type,WT)相比,Atfas1-4的根长变短、株高变矮、叶面积减小、毛状体增多,果荚变短,结籽率降低;(3)生长两周的WT经UV-B照射0、1、2、3小时后,利用半定量测定FAS1的表达量,FAS1的表达量随剂量增加发生变化。与对照组相比,1小时处理时FAS1表达量下降,2小时处理时FAS1表达增加,3小时处理时FAS1下降且下降程度大于1小时处理时。据结果推测,拟南芥中FAS1响应增强UV-B辐射,由于大亚基FAS1是CAF-1复合体的组成部分,因此推断CAF-1复合体与增强UV-B辐射响应相关;(4)经剂量为3.6 KJ·m-2·d-1的增强UV-B辐射处理后,同对照组相比,处理组根长明显变短,且Atfas1-4 UV-B根长相较于WT UV-B根长抑制严重,两者差异极显著(P<0.01)。分析推测FAS1缺失使CAF-1复合体的功能不足,导致Atfas1-4对增强UV-B辐射敏感性增强,根生长抑制加重;(5)通过二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(Nitroblue chloride,NBT)染色测定活性氧变化的研究发现,对照组中,Atfas1-4突变体的染色程度高于野生型;相较于对照组,处理组染色水平增高,且Atfas1-4 UV-B的染色程度明显高于WT UV-B。结果显示Atfas1-4在增强UV-B处理后H202、02-·含量显著增加。将Atfas1-4 UV-B转移至含谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的MS培养基恢复生长,根长部分恢复,推测在增强UV-B辐射后,Atfas1-4突变体产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)多,受到氧化胁迫严重,增强UV-B辐射下Atfas1-4的根长抑制部分受过多活性氧积累影响。(6)测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)反映拟南芥根部抗氧化酶变化情况,经过检测,对照组中SOD和CAT活性Atfas1-4较WT上升;与对照组相比,处理组抗氧化酶活性均升高,但Atfas1-4 UV-B的SOD、CAT升高程度远落后于WT UV-B。结果表明,在增强UV-B辐射后Atfas1-4突变体产生的抗氧化酶活力降低,导致ROS积累增多,影响了根的发育,导致短根。(7)经二苯氨基苯基硼酸(2-Aminoethyl diphenylborinate,DPBA)染色观测突变体Atfas1-4中黄酮醇含量,对照组中,WT与Atfas1-4染色后荧光强度相差不大;与对照组相比,处理组荧光强度明显增强;与WT UV-B相比,Atfas1-4 UV-B的荧光强度明显增强;结果说明增强UV-B辐射会使黄酮醇含量增加,Atfas1-4通过产生黄酮醇增多抵抗过多活性氧。(8)通过彗星实验观测发现,对照组中,Atfas1-4突变体已发生DNA损伤,出现轻微拖尾现象;与对照组相比,处理组均出现拖尾现象,Atfas1-4 UV-B的拖尾现象更加严重,其尾距(Olive tail moment,OTM)超过WT UV-B的两倍多,表明Atfas1-4突变体在增强UV-B处理后DNA损伤加剧。推断由于FAS1的功能缺失,使突变体对增强UV-B辐射抵御能力下降,在受到胁迫时,损伤修复能力大大降低。综上所述,本研究通过观测增强UV-B辐射前后Atfas1-4突变体的表型变化,发现在增强UV-B辐射下,Atfas1-4突变体出现根长抑制加重的表型。为了探究原因,通过测定FAS1的表达量、活性氧的变化情况、抗氧化酶的变化情况,及DNA损伤情况,推测增强UV-B辐射后,Atfas1-4突变体的根长抑制加重是由于FAS1缺失使CAF-1复合体功能不足,抗氧化酶活性增加不足,导致活性氧积累造成的;同时CAF-1的功能不足会增加对增强UV-B辐射的敏感性,破坏增强UV-B辐射后DNA损伤修复。