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兽药能促进畜禽生长、改善畜产品的肉质与口感、增加饲料利用率、减少动物的发病率、增加存活率,在现代畜牧业生产中有不可或缺的地位。但实际生产中,误用、滥用兽药,导致畜牧产品中兽药残留超标,经食物链进入人体后,易蓄积毒性、产生耐药性等、严重时威胁人体健康。呋喃它酮属于硝基呋喃类药物,半衰期只有几个小时,在体内会被迅速代谢为3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(3-amino-5-methylmorpholino-2-oxazolidinone,AMOZ)能够稳定存在,目前建立的检测呋喃它酮代谢物常用的方法是仪器分析法,这些检测法灵敏度高特异性强,但仪器昂贵、操作复杂、需要专业的人员进行操作并耗时不能够普及。本研究建立的检测AMOZ酶免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、生物素-亲和素放大酶免疫分析法(Biotin-avidin enzyme-linked immunosirbent assay,BA-ELISA)与化学发光酶免疫法(Chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)是基于抗原抗体特异性反应的酶免疫分析法,与仪器分析法比较该方法操作简便、仪器简便、检测速度快、成本低,能够对样品进行批量的快速筛查。首先,将AMOZ与对醛基苯甲酸(4-carboxybenzaldehyde,4-CBA)衍生化反应合成CPAMOZ,用核磁共振与红外光谱对合成的物质鉴定。CPAMOZ与卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)通过活化酯法偶联得到人工抗原CPAMOZ-OVA,并通过紫外扫谱进行鉴定。其次,对影响酶免疫法的主要因素优化。ELISA法最优工作浓度:包被原稀释倍数与单克隆抗体稀释倍数分别为500与2000,2%脱脂乳为封闭液,竞争时间与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(Horseradish peroxidase labelled goat antimouse lgG conjugate,HRP-IgG)孵育时间都为30 min,显色15 min。CLEIA法化学发光液的最优工作浓度为:对碘苯酚溶液与鲁米诺溶液按浓度分别为6 mmol/L与10 mmol/L按等体积比混合为化学发光A液,4μL 30%H2O2溶液滴入10 mL Tris-HCl中为B液;临用前将A液与B液等体积比混合使用。CLEIA最优工作浓度:包被原与单克隆抗体稀释倍数均为4000,2%脱脂乳作为封闭液,竞争反应与二抗孵育时间均为30 min。BA-ELISA法最优工作浓度:包被原与单克隆抗体稀释倍数分别为1000与2000,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin–horse radish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数为8000,封闭液为2%脱脂乳,竞争反应与SA-HRP孵育时间均为30 min,生物素标记羊抗鼠二抗(Biotinylated goat anti-mouse ImmunoglobulinG,Biotin-IgG)孵育时间为60min,显色时间为15 min。最后,3种酶免疫法在灵敏度、特异性、精密度和准确度4个方面进行方法评价。ELISA线性方程为y=-0.439x+0.670(R~2=0.992),IC50为2.439 ng/mL,线性范围为0.506~11.765 ng/m L;批内变异系数(Coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.4%~5.8%和2.1%~4.9%;回收率为86.7%~90.1%,CV为4.8%~7.3%。CLEIA线性方程为y=-0.493x+0.471(R~2=0.995),IC50为0.873 ng/m L,线性范围为0.215~3.545ng/m L;批内和批间CV分别为1.5%~4.3%和1.2%~5.2%;回收率为88.9%~94.2%,CV为4.2%~6.3%。BA-ELISA线性方程为y=-0.442x+0.483(R~2=0.999),IC50为0.915ng/m L,线性范围为0.192~4.367 ng/mL;批内和批间CV分别为1.3%~4.2%和1.1%~5.6%;回收率为92.5%~94.6%,CV为4.4%~9.6%。高效液相色谱法-串联质谱(High-Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometric,HPLC-MS/MS)回收率为98.7%~99.8%,CV为1.1%~2.6%。建立的3种检测AMOZ酶免疫分析法与其代谢物以及衍生物均没有交叉反应,交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。本研究建立的检测AMOZ代谢物的3种酶免疫分析法均能够满足实际检测的要求,可用于对AMOZ的快速筛查。