大肠杆菌O157为重要的食源性病原菌，其主要毒力因子之一是志贺毒素（Shiga toxin），编码志贺毒素的噬菌体为志贺毒素噬菌体（Stx噬菌体）。Stx噬菌体的溶原可使宿主菌产生Stx毒素，导致细菌致病力增强。此外 Stx噬菌体溶原与宿主菌之间还会产生哪些相互影响还不是很清楚。本研究以Stx2噬菌体ΦMin27为研究对象，试图揭示Stx2噬菌体溶原与宿主菌之间的相互调控作用，为防控产志贺毒素大肠杆菌特别是大肠杆菌O157提供一定的理论依据。　　1. Stx2噬菌体溶原感染对宿主大肠杆菌MG1655蛋白表达的影响　　通过噬菌体溶原感染和二维电泳（2-Dimensional electrophoresis，2DE）研究Stx2噬菌体ΦMin27溶原对大肠杆菌MG1655蛋白表达的影响。采用双层琼脂法及PCR技术验证获得稳定的纯化溶原株 MG1655ФMin27。采用二维电泳技术，对野生株MG1655和溶原株MG1655ФMin27在相同生长条件下的全蛋白表达谱进行了比较，结果显示蛋白表达出现差异的点有65个，选择其中的32个差异点进行了质谱鉴定（LC-MS/MS），其中有四种蛋白均与F eS合成亚单位相关，即NfuA、FdoH、SdhB和 FtnA蛋白。为进一步论证二维电泳检测结果的可靠性，选择了大肠杆菌的4个差异表达蛋白基因（nfuA、fdoH、sdhB和 ftnA）进行荧光定量 PCR（RT-PCR）验证，分析结果与全蛋白二维电泳得到的结果一致。本研究探索了噬菌体ΦMin27溶原感染前后大肠杆菌宿主MG1655蛋白表达的变化，为进一步了解噬菌体与宿主菌的相互作用提供了参考数据。　　2. nfuA、fdoH、sdhB和ftnA基因缺失株及其溶原株的构建以及铁离子对其生长特性的影响　　在二维电泳和蛋白质谱鉴定结果中，有四个差异表达蛋白NfuA、FdoH、SdhB和FtnA均与FeS合成亚单位相关，为此进一步探索其在Stx噬菌体溶原中的作用及铁离子代谢对噬菌体溶原产生的影响。利用λ噬菌体的Red重组系统，构建了大肠杆菌 MG1655的缺失株 MG1655△nfuA、MG1655△fdoH、MG1655△sdhB和MG1655△ftnA，并将nfuA片段、fdoH片段、sdhB片段和ftnA片段与pUC18质粒连接，然后分别转化入相应的突变株，得到相应的互补菌株。将Stx2噬菌体ΦMin27感染各缺失突变株，获得相应的溶原菌株。　　随后测定了野生株、溶原株、缺失株和互补株分别在普通 LB液体培养基及缺铁（添加铁螯合剂2，2’-联吡啶（DPD））和富铁（添加FeCl3）状态下的生长曲线，研究铁离子对各菌株生长的影响。结果表明在普通LB液体培养基中，nfuA及sdhB基因缺失对MG1655的生长抑制较大，fdoH及ftnA缺失株溶原前后生长曲线无明显差异，nfuA缺失株溶原后菌株生长要稍稍滞后于未溶原株，而 sdhB缺失突变株溶原 Stx2噬菌体ΦMin27后菌株生长显著快于未溶原株。250μM DPD和500μM FeCl3对野生株MG1655的生长无显著影响。在缺铁条件下（250μM DPD），fdoH和ftnA缺失株与野生株生长无明显差异，但nfuA和sdhB缺失株对铁离子缺乏比较敏感。在相应的ΦMin27噬菌体溶原株中，fdoH和ftnA缺失溶原株与野生株在缺铁（250μM DPD）和富铁（500μM FeCl3）条件下的生长均无明显差异。然而，不论是在普通 LB肉汤中还是在缺铁或富铁环境中，sdhB缺失溶原株（MG1655△sdhBΦMin27）均比野生溶原株（MG1655ΦMin27）生长更好。相反地，nfuA缺失溶原株（MG1655△nfuAΦMin27）在普通 LB肉汤中比野生溶原株（MG1655ΦMin27）生长要慢，补充Fe3+可弥补这种生长差异。而铁螯合剂DPD的添加会促进这种生长差异，且DPD浓度越大，nfuA缺失溶原株生长抑制越明显，可见nfuA在噬菌体溶原株中发挥了重要作用。　　3.大肠杆菌nfuA在Stx2噬菌体ΦMin27溶原稳定性中的作用　　为进一步探索大肠杆菌nfuA在Stx噬菌体溶原菌中所发挥的作用，对nfuA突变溶原株进行进一步的研究。为验证nfuA缺失溶原株是否发生了噬菌体自发诱导，在噬菌体未诱导状态下检测了溶原菌培养上清液中噬菌体以及 Stx2毒素。结果显示，缺铁条件下（250μM DPD），存在于nfuA缺失溶原株培养上清液中的噬菌体达到了106 PFU/m l以上，显著高于野生溶原株和其他突变溶原株。相应地，在Stx2对Vero细胞的毒性检测中，nfuA缺失溶原株上清液中的Stx2毒性也明显高于其他各突变溶原株。同时对大肠杆菌O157:H7 Min27进行了nfuA基因缺失株的构建，并检测了其培养上清液中噬菌体以及Stx2，得到了一致的结果。为了验证噬菌体是否进入了裂解周期，采用qRT-PCR检测了与裂解周期相关的调控蛋白编码基因cI、cII、cIII和cro在nfuA缺失和缺铁条件下的mRNA转录水平。结果显示：在铁螯合剂DPD（250μM）存在条件下，与野生溶原株相比，nfuA缺失溶原株cro基因表达水平上调了9倍以上，cI、cII和cIII基因表达水平下调了5～20倍。因此，nfuA的缺失影响了与噬菌体溶原生命周期相关的基因表达，促使噬菌体进入了裂解周期，在缺铁条件下，这种现象更为显著。推测nfuA在维持噬菌体溶原中发挥了极其重要的作用，可维持菌株中的噬菌体保持溶原状态。　　4. Stx2噬菌体溶原对大肠杆菌运动性及其相关基因表达的影响　　本实验通过基因缺失和噬菌体溶原转换研究大肠杆菌运动相关基因flhDC、fliA、fliD和fliE对Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的影响。同时利用Red重组酶系统，构建了大肠杆菌 MG1655的缺失株 MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE，并将目的片段分别与pUC18质粒连接，然后分别转化入相应的突变株，得到相应的互补菌株。通过Stx2噬菌体ΦMin27的感染获得各缺失株的溶原株。随后测定了各菌株的运动能力，并通过qRT-PCR检测了f lhD C缺失对溶原菌和野生株几个运动相关基因表达量的影响。结果表明：ΦMin27溶原可增强大肠杆菌MG1655的fliA和 fliD基因的表达，提高菌株MG1655运动能力；flhDC基因缺失增强了fliA和fliD基因的表达，但未改变菌株运动特性；而MG1655△flhDC溶原菌则不具有运动能力，基因转录水平分析结果显示MG1655△flhDC溶原ΦMin27后，显著抑制了fliA和fliD基因的表达，但并未影响 fliE基因的表达。fliA、fliD和 fliE单个基因的缺失并不影响大肠杆菌MG1655野生株及其溶原株的运动特性。综合研究结果，提示fliA和fliD基因共同参与调控鞭毛运动，f lhD C基因可对噬菌体溶原株的运动性产生影响，为进一步研究噬菌体溶原影响宿主菌运动调控机制提供理论依据。