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目的:沙门菌作为兼性胞内菌,感染后在巨噬细胞内的命运取决于细胞杀伤能力和细菌毒力相互作用的结果。中性粒细胞是数量最多的白细胞,具有趋化、吞噬和杀伤作用。在感染早期中性粒细胞迅速到达感染部位发挥较巨噬细胞更强的杀伤清除细菌功能,并作为“清道夫”能有效清除凋亡的巨噬细胞,在机体防御沙门菌感染中亦发挥重要的作用。自噬是细胞内自身功能受损的大分子物质、细胞器及入侵的病原生物等成分被溶酶体降解的过程。细胞Ⅰ型干扰素反应是机体抗病毒的第一道防线,其在抗菌固有免疫反应中作用因细菌不同而异,能够促进细胞因子和趋化因子的分泌影响机体炎症反应。本课题组既往研究发现,沙门菌质粒毒力基因spv能抑制自噬并影响中性粒细胞的功能。为进一步探讨spv对细菌逃逸固有免疫反应的影响及机制,本研究第一部分用携带spv基因的鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和spv基因缺陷株STM-Δspv感染巨噬细胞模型,探讨spv对细胞自噬和Ⅰ型干扰素反应的影响。第二部分以仅有固有免疫系统的斑马鱼幼鱼作为模式动物,进一步探讨spv抑制自噬和细胞Ⅰ型干扰素反应及其对中性粒细胞趋化功能的影响,为阐明spv的致病机制及其对机体固有免疫功能的影响提供理论和实验依据。方法:一、spv对巨噬细胞自噬和I型干扰素反应的影响1.spv对巨噬细胞自噬的影响STM-WT和STM-Δspv以感染复数(mutiplicity of infection,MOI)10:1感染小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7。于感染后1 h、2 h、4 h和6 h收集细胞,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平,比较两组之间的差异并确定激活自噬的时相。2.spv对巨噬细胞I型干扰素反应的影响用STM-WT和STM-Δspv分别与RAW264.7细胞共培养,于感染后2 h、4 h和6 h收集细胞,实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-q PCR)检测I型干扰素反应相关基因TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA转录水平。3.spv对巨噬细胞自噬和I型干扰素反应的影响用5 n M自噬激动剂Torin 1预处理RAW264.7细胞3 h,STM-WT和STM-Δspv分别与细胞共培养。Western Blot检测感染后2 h细胞自噬相关蛋白LC3的表达水平;RT-q PCR检测感染后4 h TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA转录水平。二、spv对斑马鱼幼鱼自噬和Ⅰ型干扰素反应及中性粒细胞趋化的影响1.spv对斑马鱼幼鱼自噬和Ⅰ型干扰素反应的影响109 CFU/ml STM-WT和STM-Δspv浸染受精后5 d(days post fertilization,dpf)的斑马鱼幼鱼。收集感染后6 h、8 h和10 h幼鱼,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平;RT-q PCR检测斑马鱼I型干扰素反应相关基因IRF3、IRF7、和IFN-β的m RNA转录水平。2.spv对中性粒细胞趋化功能的影响用STM-WT和STM-Δspv浸染斑马鱼幼鱼。感染后6 h、8 h和10 h,RT-q PCR检测细胞因子IFN-γ、趋化因子CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA转录水平。用红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)标记的STM-WT和STM-Δspv感染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记中性粒细胞的转基因斑马鱼Tg(lyz:GFP),激光共聚焦显微镜观察细菌播散情况及与中性粒细胞的相互作用。3.spv对自噬、I型干扰素反应和中性粒细胞趋化功能的影响用0.4μmol Torin 1预处理斑马鱼幼鱼48 h,STM-WT和STM-Δspv感染幼鱼。感染后8 h收集斑马鱼,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3的表达水平;RT-q PCR检测IRF3、IRF7、IFN-β、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA转录水平。结果:一.spv对巨噬细胞自噬和I型干扰素反应的影响1.spv对巨噬细胞自噬的影响Western Blot结果显示,感染后1 h和2 h STM-WT组LC3-Ⅱ水平低于STM-Δspv组(P<0.05);感染后4 h和6 h组间LC3-Ⅱ水平均无明显差异(P>0.05)。感染后1 h和2 h两组之间p62水平无明显差异(P>0.05);感染后4 h STM-WT组p62水平明显高于STM-Δspv组(P<0.05);感染后6 h两感染组p62水平均高于对照组(P<0.05),组间无明显差异(P>0.05)。2.spv对巨噬细胞I型干扰素反应的影响RT-q PCR结果显示,感染后2 h,4 h和6 h STM-WT感染组基因TRIF,TRAF3和IFN-β的m RNA转录水平均明显低于STM-Δspv感染组(P<0.05)。3.spv对巨噬细胞自噬和I型干扰素反应的影响Western Blot检测自噬相关蛋白LC3结果显示,感染后2 h STM-WT组LC3-Ⅱ表达水平低于STM-Δspv组;用Torin 1预处理后,STM-WT组细胞LC3-Ⅱ表达水平明显增高(P<0.05),组间无明显差异(P>0.05)。RT-q PCR结果显示,感染后4h STM-WT组TRIF、TRAF3和IFN-β的m RNA转录水平低于STM-Δspv组(P>0.05);用Torin 1预处理后STM-WT组TRIF、TRAF3和IFN-β转录水平均升高(P<0.05)且组间无显著差异(P>0.05)。二.spv对斑马鱼幼鱼自噬和Ⅰ型干扰素反应及中性粒细胞趋化的影响1.spv对斑马鱼幼鱼自噬和Ⅰ型干扰素反应的影响检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62结果显示,在感染后6 h和8 h STM-Δspv组LC3-Ⅱ表达水平高于STM-WT组(P<0.05);感染后8 h p62水平明显低于STM-WT组(P<0.05);感染后10 h两组LC3-Ⅱ和p62表达水平无明显差异。检测斑马鱼幼鱼Ⅰ型干扰素反应相关基因IRF3、IRF7和IFN 1的m RNA转录水平,结果显示在感染后6 h和8 h STM-Δspv组IRF3、IRF7和IFN 1基因转录水平均明显高于STM-WT组(P<0.05),感染后10 h两组之间无明显差异(P>0.05)。2.spv对中性粒细胞趋化功能的影响RT-q PCR检测IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2基因的m RNA转录水平结果显示,与STM-WT组相比,在感染后6 h和8 h STM-Δspv组IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2转录水平均明显升高(P<0.05)。激光共聚焦显微镜观察到RFP-STM-WT组细菌播散明显多于RFP-STM-Δspv组,且在感染后8 h和10 h明显观察到中性粒细胞聚集减少。4.spv对自噬、Ⅰ型干扰素反应和中性粒细胞趋化的影响Western Blot检测LC3结果显示,感染后8 h STM-WT组LC3-Ⅱ表达水平低于STM-Δspv组;用Torin 1预处理后,STM-WT组LC3-Ⅱ表达水平明显增高,组间无明显差异(P>0.05)。RT-q PCR结果显示,在感染后8 h STM-WT组IRF3、IRF7、IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2的m RNA转录水平均低于STM-Δspv组(P<0.05)。用Torin 1预处理后,两组IRF3和IRF7水平均显著增高,组间差异无统计学意义(P>0.05);STM-WT组IFN 1、IFN-γ、CXCL8-L1和CXCL8-L2转录水平均升高,组间无显著差异(P>0.05)。结论:1.spv通过抑制自噬抑制巨噬细胞Ⅰ型干扰素反应。2.spv在斑马鱼幼鱼感染模型中通过抑制自噬抑制Ⅰ型干扰素反应。3.spv通过抑制Ⅰ型干扰素反应影响中性粒细胞趋化功能。