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目的:本研究通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)在健康人和乳腺癌患者血清中的表达情况,进一步筛选出CK18高表达的人乳腺癌BT549细胞株,探讨CK18在BT549细胞中的生物学功能及其潜在的分子机制。方法:通过Western Blot法检测CK18在健康人和乳腺癌患者血清中的表达,并在培养的不同的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、MCF-7、MCF-10A、4T1中检测了CK18的差异表达。使用慢病毒载体靶向的CK18基因和对照空白载体分别感染CK18高表达的人乳腺BT549细胞,建立CK18敲除的稳定表达细胞株,并采用WB技术进行鉴定。进一步在CK18表达沉默的BT549细胞中通过CCK-8法和平板克隆方法检测CK18沉默后BT549细胞在体外增殖能力的改变;通过流式细胞技术(PE-AnnexinV双染法)检测CK18基因沉默后对BT549细胞凋亡的影响;通过PI-FACS法检测沉默CK18对BT549细胞周期的影响;通过划痕实验和Transwell实验检测CK18基因沉默对BT549细胞体外运动侵袭能力的影响。进一步通过WB法检测侵袭运动相关分子Twist1、E-cadherin、vimentin蛋白的表达,初步探讨CK18基因沉默对细胞侵袭运动的潜在分子机制。结果:在健康人和乳腺癌患者血清中用WB检测CK18的表达,发现在26例健康人血清中,CK18阳性表达25例,阳性率96%;在26例乳腺癌患者血清中,CK18阳性表达19例,阳性率73%。然后在CK18阳性的乳腺癌患者与健康人血清中分析CK18/GAPDH相对灰度值,发现较正常人血清(0.11±0.06),乳腺癌患者血清中CK18(0.24±0.10)相对表达增高。不同转移潜能的乳腺癌细胞中检测CK18的表达情况,WB结果显示:CK18在转移潜能较高的人乳腺癌BT549、MDA-MB-231细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞中高水平表达,而在低转移潜能人乳腺癌MCF-7和正常人乳腺上皮MCF-10A细胞系中表达低。通过RNAi干扰技术建立CK18沉默的稳定表达BT549细胞株:以未感染的人乳腺癌BT549细胞为空白对照组(Wt),以感染空载体病毒为阴性对照组(shCon),以感染含CK-18重组子病毒为实验组(CK18 shRNA-21、-22、-23和-24)。WB鉴定发现CK18 shRNA-23实验组沉默效率最高,达73%,故选择感染CK18 shRNA-23的BT549细胞为下一步研究的模型。CCK-8实验和平板克隆实验结果:与空白对照组(Wt)和阴性对照组(shCon)相比,实验组CK18-sh23细胞在24h、48h和72h时,时间依赖性降低,克隆形成能力降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示下调CK18可抑制BT549细胞生长增殖。细胞凋亡FACS结果显示:实验组细胞发生早期凋亡细胞数明显增多,早期凋亡细胞数占总细胞数的百分比为(14.77±1.17)%,较对照组的(7.30±0.82)%和空白对照组的(6.50±0.50)%明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期实验结果提示:实验组中G2期细胞所占比例为(23.23±4.91)%,较阴性对照组的(15.83±1.01)%和空白对照组的(14.33±2.84)%增加(P<0.05)。细胞划痕实验发现较空白组细胞和阴性对照组细胞,实验组细胞的运动能力显著降低。进一步用Transwell实验证实:实验组运动和侵袭实验中每个视野跨膜细胞数分别(43.33±1.53)个和(30.33±0.58)个,显著低于空白对照组(运动(63.67±5.13)和侵袭(54.33±4.73)的细胞个数)以及阴性对照组(运动(62.67±3.79)和侵袭(50.33±3.51)的细胞个数),差异均具有统计学意义(P<0.05)。WB结果提示随着CK18表达降低,Twist1和Vimentin蛋白表达下调,而E-cadherin蛋白表达上调。结论:1.较正常人血清相比,CK18在乳腺癌血清中高表达,且CK18的表达与乳腺癌细胞的转移潜能正相关;2.人乳腺癌细胞BT549中CK18表达下调,明显抑制细胞增殖、克隆形成能力、降低体外侵袭运动能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期;3.CK18可能是通过Twist1通路来诱导EMT发生,参与BT549细胞侵袭转移过程。