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目的：
利用iTARQ技术和定量的WesternBlot技术评价孕期恐应激对其胎盘组织蛋白质表达的影响，以期从蛋白水平探讨孕期恐应激影响其子代发育的胎盘调控机制。
方法：
对购买的70只80日龄Wistar大鼠(其中雌鼠45只，体重235±15g；雄鼠25只，体重270±20g)适应性喂养一周，采用旷场实验和Morris水迷宫实验选取基准线一致的大鼠按雌雄2∶1合笼，次日检查受孕情况。按随机数字表法将陆续受孕的大鼠40只分为对照组和应激组，每组20只。另选取雄鼠10只留做电击鼠，其余鼠处死。从受孕第一天开始，心理应激组孕鼠采用旁观电击法进行造模，对照组只放电击笼中不予电击。在孕20日，每组随机抽取10只孕鼠进行剖宫取胎盘和仔鼠，并观察每只孕鼠的存活胎、吸收胎及死胎情况和测量胎盘的重量(PW )、直径、面积和仔鼠的重量，计算PW/FW比率，每组剩余10只孕鼠饲养至自然生产，记录其产仔数并观察仔鼠的一般发育情况，至仔鼠30日龄运用旷场实验和Morris水迷宫实验检测仔鼠发育情况。采用iTRAQ技术按FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的标准选取胎盘组织差异表达蛋白质，通过GO数据库及KEGGPathway数据库进行GO功能和Pathway通路进行分析，运用Cytoscape软件做差异表达蛋白的网络互作分析，并通过WesternBlot技术对筛选出的部分差异表达蛋白质进行验证。
结果：
1.孕期恐应激对胎盘和仔鼠发育的影响及二者之间的相关性
1.1.孕期恐应激对胎盘、新生仔鼠及30日龄仔鼠的影响
与对照组比较，应激组胎盘重量减轻，胎盘面积和胎盘直径减小，差异均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较，应激组仔鼠体重减轻，PW/FW下降，仔数出牙、被毛和惊跳反射时间均较晚，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组仔鼠张耳、开眼和翻身时间均较晚，产仔数减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；且应激组中吸收胎的发生率是对照组的2倍多，死胎发生率是对照组的1.6倍多；与对照组相比，应激组30日龄仔鼠水平得分、垂直得分均减少，大便粒数增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组修饰次数均减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；与对照组比，应激组30日龄仔鼠第1，2,3天平均逃避潜伏期和20%边缘区域停留时间均延长、游泳速度减慢及跨台次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
1.2.孕期恐应激所致胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育的相关性
胎盘重量和胎盘面积分别与仔鼠体重呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠出牙时间呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠张耳、开眼、被毛、翻身和惊跳反射时间呈负相关，PW/FW和胎盘直径与仔鼠体重呈正相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组比，胎盘重量和胎盘面积与水平得分、垂直得分、游泳速度和跨台次数呈正比，胎盘重量、胎盘面积和PW/FW与大便粒数、20%边缘区域呈反比，胎盘直径和胎盘面积与平均逃避潜伏期呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量与修饰次数呈正相关，胎盘直径和PW/FW与水平得分、垂直得分、游泳速度、跨台次数呈正相关，胎盘直径与大便粒数、20%边缘区域呈负相关，胎盘重量、胎盘直径、胎盘面积和PW/FW与修饰次数呈正相关，PW/FW与平均逃避潜伏期呈负相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
2.孕期恐应激对胎盘组织蛋白质表达检测结果
2.1.差异表达蛋白的鉴定结果
在FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的条件下共筛选出300种差异表达蛋白，其中有152种表达上调，148种表达下调；
2.2.差异表达蛋白GO功能富集结果
300种差异表达蛋白共涉及38种细胞组分、103种生物过程和41种分子功能。其中细胞组分主要涉及了核糖体、染色质、ATP酶及细胞外基质等；生物过程主要涉及细胞代谢过程的负调控、应激反应的调节、蛋白质靶向调控、肌动蛋白丝解聚作用、和葡萄糖稳态等；分子功能主要涉及核糖体的结构组成、细胞外基质结构组成、氨基酸跨膜转运体活性及伴侣蛋白绑定等；
2.3.差异表达蛋白Pathway通路分析结果
300个差异表达蛋白共涉及12种生物途径，主要与应激相关的涉及核糖体信号通路、PI3K-AKT信号传导通路和ECM-受体相互作用等。
2.4.差异表达蛋白网络互作分析结果
对300种差异表达蛋白进行互作网络分析，110个差异蛋白之间存在相互作用且构建出网络互作图，余190个差异表达蛋白不存在网络互作。其中，在相互作用网络中DJ-1、PPARγ、14-3-3ζ、Cofilin-1、FTO、14-3-3θ蛋白、HSP90β以及HSP60等8个蛋白的点度中心度数值均较大；
3.对差异表达蛋白的验证结果
选择DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60和ATP1A15个差异表达蛋白进行验证。与对照组比较，应激组DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60四个蛋白均有下调趋势，与iTRAQ结果检测一致。
结论：
1.孕期恐应激影响胎盘、新生仔鼠和30日龄仔鼠的正常发育，且胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育有一定的相关性；
2.孕期恐应激影响胎盘上的蛋白质主要分布于血管、线粒体及细胞骨架上，并通过核糖体信号通路传导、PI3K/AKT信号通路传导及ECM-受体相互作用等途径实现对仔鼠发育的影响。
利用iTARQ技术和定量的WesternBlot技术评价孕期恐应激对其胎盘组织蛋白质表达的影响，以期从蛋白水平探讨孕期恐应激影响其子代发育的胎盘调控机制。
方法：
对购买的70只80日龄Wistar大鼠(其中雌鼠45只，体重235±15g；雄鼠25只，体重270±20g)适应性喂养一周，采用旷场实验和Morris水迷宫实验选取基准线一致的大鼠按雌雄2∶1合笼，次日检查受孕情况。按随机数字表法将陆续受孕的大鼠40只分为对照组和应激组，每组20只。另选取雄鼠10只留做电击鼠，其余鼠处死。从受孕第一天开始，心理应激组孕鼠采用旁观电击法进行造模，对照组只放电击笼中不予电击。在孕20日，每组随机抽取10只孕鼠进行剖宫取胎盘和仔鼠，并观察每只孕鼠的存活胎、吸收胎及死胎情况和测量胎盘的重量(PW )、直径、面积和仔鼠的重量，计算PW/FW比率，每组剩余10只孕鼠饲养至自然生产，记录其产仔数并观察仔鼠的一般发育情况，至仔鼠30日龄运用旷场实验和Morris水迷宫实验检测仔鼠发育情况。采用iTRAQ技术按FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的标准选取胎盘组织差异表达蛋白质，通过GO数据库及KEGGPathway数据库进行GO功能和Pathway通路进行分析，运用Cytoscape软件做差异表达蛋白的网络互作分析，并通过WesternBlot技术对筛选出的部分差异表达蛋白质进行验证。
结果：
1.孕期恐应激对胎盘和仔鼠发育的影响及二者之间的相关性
1.1.孕期恐应激对胎盘、新生仔鼠及30日龄仔鼠的影响
与对照组比较，应激组胎盘重量减轻，胎盘面积和胎盘直径减小，差异均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较，应激组仔鼠体重减轻，PW/FW下降，仔数出牙、被毛和惊跳反射时间均较晚，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组仔鼠张耳、开眼和翻身时间均较晚，产仔数减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；且应激组中吸收胎的发生率是对照组的2倍多，死胎发生率是对照组的1.6倍多；与对照组相比，应激组30日龄仔鼠水平得分、垂直得分均减少，大便粒数增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组修饰次数均减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；与对照组比，应激组30日龄仔鼠第1，2,3天平均逃避潜伏期和20%边缘区域停留时间均延长、游泳速度减慢及跨台次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
1.2.孕期恐应激所致胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育的相关性
胎盘重量和胎盘面积分别与仔鼠体重呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠出牙时间呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠张耳、开眼、被毛、翻身和惊跳反射时间呈负相关，PW/FW和胎盘直径与仔鼠体重呈正相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组比，胎盘重量和胎盘面积与水平得分、垂直得分、游泳速度和跨台次数呈正比，胎盘重量、胎盘面积和PW/FW与大便粒数、20%边缘区域呈反比，胎盘直径和胎盘面积与平均逃避潜伏期呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量与修饰次数呈正相关，胎盘直径和PW/FW与水平得分、垂直得分、游泳速度、跨台次数呈正相关，胎盘直径与大便粒数、20%边缘区域呈负相关，胎盘重量、胎盘直径、胎盘面积和PW/FW与修饰次数呈正相关，PW/FW与平均逃避潜伏期呈负相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
2.孕期恐应激对胎盘组织蛋白质表达检测结果
2.1.差异表达蛋白的鉴定结果
在FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的条件下共筛选出300种差异表达蛋白，其中有152种表达上调，148种表达下调；
2.2.差异表达蛋白GO功能富集结果
300种差异表达蛋白共涉及38种细胞组分、103种生物过程和41种分子功能。其中细胞组分主要涉及了核糖体、染色质、ATP酶及细胞外基质等；生物过程主要涉及细胞代谢过程的负调控、应激反应的调节、蛋白质靶向调控、肌动蛋白丝解聚作用、和葡萄糖稳态等；分子功能主要涉及核糖体的结构组成、细胞外基质结构组成、氨基酸跨膜转运体活性及伴侣蛋白绑定等；
2.3.差异表达蛋白Pathway通路分析结果
300个差异表达蛋白共涉及12种生物途径，主要与应激相关的涉及核糖体信号通路、PI3K-AKT信号传导通路和ECM-受体相互作用等。
2.4.差异表达蛋白网络互作分析结果
对300种差异表达蛋白进行互作网络分析，110个差异蛋白之间存在相互作用且构建出网络互作图，余190个差异表达蛋白不存在网络互作。其中，在相互作用网络中DJ-1、PPARγ、14-3-3ζ、Cofilin-1、FTO、14-3-3θ蛋白、HSP90β以及HSP60等8个蛋白的点度中心度数值均较大；
3.对差异表达蛋白的验证结果
选择DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60和ATP1A15个差异表达蛋白进行验证。与对照组比较，应激组DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60四个蛋白均有下调趋势，与iTRAQ结果检测一致。
结论：
1.孕期恐应激影响胎盘、新生仔鼠和30日龄仔鼠的正常发育，且胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育有一定的相关性；
2.孕期恐应激影响胎盘上的蛋白质主要分布于血管、线粒体及细胞骨架上，并通过核糖体信号通路传导、PI3K/AKT信号通路传导及ECM-受体相互作用等途径实现对仔鼠发育的影响。