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【背景】当前,女性乳腺癌已成为全球第一大癌症,位居女性癌症发病率与死亡率之首。约70%的女性乳腺癌患者为雌激素受体（estrogen receptorα,ER）阳性（+）表达,首选内分泌治疗,他莫昔芬（tamoxifen,Tam）作为经典一线药物,通过竞争结合ER来拮抗雌激素对乳腺癌细胞的促生长作用,发挥抗肿瘤效应。然而,Tam耐药是影响该类患者预后的主要挑战。p110α是PIK3CA所编码的PI3K的一种催化亚基,对PI3K/AKT通路的活性至关重要。PIK3CA高频突变是Tam耐药的已知诱因,p110α的表达水平也是影响Tam敏感性的因素。另一方面,Tam耐药的一个重要特征在于管腔型生物标志物的减少。本研究中,我们发现N6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1（N6 adenine-specific DNA methyltransferase 1,N6AMT1）是管腔型乳腺癌（ER+）的一种潜在生物标志物,并且其下调通过调控p110α的表达参与了Tam耐药的发生。【目的】（1）明确管腔型乳腺癌生物标志物N6AMT1分子表达下调的机制;（2）明确N6AMT1与Tam耐药的关系;（3）阐明N6AMT1与p110α的调控关系及其对Tam耐药的影响。【方法】（1）通过乳腺癌细胞系的蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）,Breast Cancer Gene-Expression Miner（bc-Gen Ex Miner）数据库分析以及临床标本的免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）检测,确定N6AMT1在各乳腺癌分型中的表达水平分布。（2）分别构建N6AMT1稳定敲减和过表达的细胞系(MCF-7-sh N6AMT1和MCF-7Tam R-N6AMT1),用CCK-8法及移植瘤技术分别检测N6AMT1敲减及过表达细胞对Tam的体外、体内敏感性。（3）通过PROMO与Ch IPBase数据库联合分析确定N6AMT1潜在的转录因子,再通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）-qPCR与荧光素酶报告基因技术（构建N6AMT1启动子区的报告质粒p GL-N6-WT;构建突变了启动子区两个潜在的转录因子结合位点的报告质粒p GL-N6-Mut1和p GL-N6-Mut2）进一步验证该转录因子对N6AMT1的转录调控。（4）通过6m A-IP-seq技术与RT-qPCR技术确定N6AMT1对p110α的调节与6m A修饰水平及转录水平的关系。（5）运用WB检测N6AMT1敲减前后,细胞在蛋白翻译抑制剂处理不同时间的条件下p110α的稳定性,检查bc-Gen Ex Miner数据库中N6AMT1与NEDD4L的相关性,运用RT-qPCR技术与WB检测N6AMT1敲减前后细胞,亲本与耐药细胞NEDD4L,PIK3CA（p110α）,p-AKT（S473）等的表达水平。（6）分别在敲减N6AMT1的细胞中过表达NEDD4L（MCF-7-sh N6AMT1/NEDD4L）,在过表达N6AMT1的细胞中瞬时敲减NEDD4L(MCF-7Tam R-N6AMT1/si NEDD4L),运用RT-qPCR与WB检测其NEDD4L,PIK3CA（p110α）,p-AKT（S473）等的表达水平,CCK-8法检测上述细胞对Tam的敏感性。（7）对敲减N6AMT1前后的细胞进行过表达或瞬时敲减NEDD4L,在MG-132处理后,WB检测p110α的表达水平。（8）运用IHC技术检测FOXA1,N6AMT1,NEDD4L,p110α在153例经Tam治疗的ER+乳腺癌患者手术标本中的表达水平,用皮尔森相关性分析揭示各调控因子之间的相关性,再用Kaplan Meier生存分析揭示这些调控因子表达水平对患者生存期的影响。【结果】（1）WB结果显示N6AMT1在管腔型乳腺癌细胞系（MDA-MB-453,MCF-7及T47D）的表达水平显著上调,bc-Gen Ex Miner分析结果显示N6AMT1在管腔型乳腺癌组织的表达水平显著上调（n=566,p＜0.001）,N6AMT1与ER的表达呈正相关（r=0.39,n=4421,p＜0.0001）。IHC结果显示,N6AMT1在管腔型乳腺癌手术标本的表达水平显著上调（n=31,p＜0.01）。（2）CCK-8结果显示MCF-7-sh N6AMT1细胞对Tam敏感性呈显著下调（p＜0.001）,MCF-7Tam R-N6AMT1细胞对Tam敏感性呈显著上调（p＜0.001）。移植瘤实验结果显示N6AMT1敲减细胞的移植瘤对Tam敏感性显著下调（p＜0.05）,N6AMT1敲减细胞的移植瘤与对照细胞的移植瘤相比,瘤重明显增加（p＜0.01）。（3）PROMO与Ch IPBase数据库联合预测结果显示,CEBP/β,FOXA1及TP53是N6AMT1潜在的转录因子。RT-qPCR结果显示FOXA1的m RNA水平在耐药细胞中显著下调（p＜0.001）。FOXA1的Ch IP-qPCR结果显示包含N6AMT1 site2（TGACTATTGACATTT）的DNA片段具有最高的富集倍数（Relative enrichment=13.00,p＜0.001）。双荧光素酶报告基因结果表明,相较于对照组,在FOXA1敲减后的细胞转染pGL-WT及pGL-Mut1时,双荧光素酶相对活性明显降低（p＜0.05）;而在FOXA1敲减后的细胞转染p GL-Mut2时,双荧光素酶相对活性无明显变化。（4）6m A-IP-seq结果显示,N6AMT1敲减前后PIK3CA的6m A水平无明显变化。RT-qPCR结果显示,N6AMT1敲减或过表达前后PIK3CA的m RNA水平无明显变化。（5）WB结果显示,相比于对照细胞,MCF-7-sh N6AMT1细胞中p110α的稳定性增加。bc-Gen Ex Miner分析结果显示N6AMT1与NEDD4L呈显著正相关（r=0.24,n=3685,p＜0.0001）。RT-qPCR与WB结果显示,相比于对照细胞及亲本细胞,N6AMT1敲减细胞及耐药细胞的NEDD4L的m RNA及蛋白水平明显下调,p110α及p-AKT（S473）的蛋白水平明显上调。（6）RT-qPCR及WB结果显示,相比于对照细胞,MCF-7-sh N6AMT1/NEDD4L细胞NEDD4L的m RNA及蛋白水平明显上调,p110α及p-AKT（S473）的蛋白水平明显下调;相比于对照细胞,MCF-7Tam R-N6AMT1/si NEDD4L细胞NEDD4L的m RNA及蛋白水平明显下调,p110α及p-AKT（S473）的蛋白水平明显上调,且这种过表达/敲减不会改变FOXA1及N6AMT1的m RNA及蛋白水平。CCK-8结果显示,相比于对照细胞,MCF-7-sh N6AMT1/NEDD4L细胞对Tam的敏感性明显增加（p＜0.05）,MCF-7Tam R-N6AMT1/si NEDD4L细胞对Tam的敏感性明显降低（p＜0.05）。（7）WB结果显示,MCF-7-sh N6AMT1/NEDD4L细胞用MG-132处理后,相比于未处理组,p110α表达水平增加。MCF-7-sh NC/si NEDD4L细胞用MG-132处理后,相比于未处理组,p110α表达水平没有明显变化。（8）IHC结果显示,在Tam敏感患者中,FOXA1、N6AMT1及NEDD4L的表达增加,而p110α的表达减少;在Tam耐药患者中,FOXA1、N6AMT1及NEDD4L的表达减少,而p110α的表达增加。皮尔森相关性分析结果显示,FOXA1与N6AMT1（n=153,p＜0.0001,r=0.3949）、NEDD4L（n=153,p=0.0036,r=0.2337）具有明显正相关关系,与p110α具有明显负相关关系（n=153,p＜0.0001,r=-0.6295）。N6AMT1与NEDD4L具有明显正相关关系（n=153,p＜0.0001,r=0.4094）,与p110α具有明显负相关关系（n=153,p＜0.0001,r=0.-4491）。NEDD4L与p110α具有明显负相关关系（n=153,p＜0.0001,r=0.-6295）。Kaplan Meier生存分析结果显示,FOXA1（p＜0.0001）、N6AMT1（p＜0.0001）及NEDD4L（p=0.0188）高表达的患者（n=153）具有更好的无病生存期,p110α低表达（p＜0.0001）的患者具有更好的无病生存期。【结论】N6AMT1在转录水平上受FOXA1的调控,低表达的N6AMT1可通过下调NEDD4L的表达,使后者所介导的p110α的降解受抑制而活化PI3K/AKT通路,产生Tam耐药。