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前列腺癌是最常见的男性肿瘤，属于高发性癌症。许多证据表明，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）可诱导癌细胞的凋亡，因此，TRAIL有希望成为前列腺癌治疗的生物制剂。但是，目前调控TRAIL表达的载体缺少肿瘤细胞的特异性，因此对正常细胞，特别是肝细胞也具有细胞毒性作用。本文为解决这个问题，将miRNA反应元件（MRE）miR-143、 miR-145以及miR-122插入腺病毒载体，成功构建Ad-TRAIL-M3腺病毒载体来控制TRAIL的表达。miR-143、miR-145和miR-122在肝细胞中特异性表达，而在前列腺癌中表达水平降低。Ad-TRAIL-M3将TRAIL以MRE调控方式表达，从而在前列腺癌中特异性表达高水平TRAIL，通过诱导凋亡抑制前列腺癌细胞的生长，而在正常细胞中没有表达。随后在PC-3移植瘤小鼠的研究中，更进一步证明了Ad-TRAIL-M3可抑制肿瘤的生长并且不具有细胞毒性，具有较高的生物安全性。这个基于miRNA的基因治疗有希望成为前列腺癌治疗方法。具体研究如下：1.实验路线1.1检测miR-143、miR-145和miR-122在原发性前列腺癌和相应的非肿瘤前列腺组织、前列腺癌细胞株、正常前列腺细胞株和肝细胞中的表达量。1.1.1人正常前列腺上皮细胞株PNT2，人正常肝细胞L-02，激素非依赖性前列腺癌PC-3和激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞培养。1.1.2通过qPCR比较上述两种正常细胞系和人两种前列腺癌细胞系中miR-143、miR-145和miR-122表达水平的差异。1.1.3收集患者的前列腺癌标本、新鲜癌组织及非癌变前列腺组织。1.1.4通过qPCR检测比较前列腺癌组织和正常前列腺组织中miR-143、miR-145和miR-122表达水平的差异。1.2检测miR-143、miR-145和miR-122的MRE是否可以用于在前列腺癌细胞中表达目标基因1.2.1将miR-143、miR-145和miR-122的MRE拷贝到荧光素酶的载体编码区的下游部位，构建psiCheck2-3MRE。1.2.2将psiCheck2和psiCheck2-3MRE转染前列腺癌细胞，48小时后用双荧光素酶报告基因系统确定其荧光素酶活性。1.3miR-143、miR-145和miR-122的MRE是否限制前列腺癌细胞中腺病毒调控的TRAIL表达1.3.1将两个miR-143、miR-145和miR-122的MRE拷贝连接进腺病毒空载构建了含MRE的TRAIL表达载体，Ad-TRAIL-M3。1.3.2将Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-M3转染PNT2、L-02、PC-3和LNCaP后，通过免疫印迹法检测TRAIL的表达。1.3.3将Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-M3转染PNT2、L-02、PC-3和LNCaP后，通过ELISA检测TRAIL的表达。1.4检测Ad-TRAIL-M3调控TRAIL表达是否与miR-143、miR-145和miR-122的表达量相关1.4.1将合成的miRNA抑制剂和模拟物加入到培养的L-02和PC-3细胞中。通过免疫印迹法检测TRAIL的表达量。1.5Ad-TRAIL-M3是否能在对正常细胞没显著毒性的情况下杀死前列腺癌细胞1.5.1将Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-M3转染PNT2、L-02，MTT试验检测Ad-TRAIL-M3是否能在对正常细胞没显著毒性的情况下杀死前列腺癌细胞。1.6Ad-TRAIL-M3是否能选择性的诱导前列腺癌细胞凋亡1.6.1将Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-M3转染L-02和PC-3细胞，用流式细胞仪检测细胞周期，分析Ad-TRAIL-M3是否能选择性的诱导前列腺癌细胞凋亡。1.6.2免疫印迹法检测活化型caspase3和PARP，确定Ad-TRAIL-M3感染细胞的凋亡激活的信号通路。1.7Ad-TRAIL-M3在体内对PC-3前列腺癌是否具有抑制作用1.7.1通过肿瘤部位注射Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-M3、Ad-EGFP和PBS，并定期测量肿瘤直径。1.7.2免疫组化分析肿瘤切片分析TRAIL在PC-3移植瘤中表达情况。1.8Ad-TRAIL-M3是否能保护肝细胞，免受TRAIL诱导的细胞毒的影响1.8.1尾静脉给予20只正常小鼠注射Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-M3、Ad-EGFP和PBS（n=5），随后收集血样，检测ALT（肝损伤标志物）。2.结果2.1miR-143、miR-145和miR-122在前列腺癌细胞中表达下调实验结果显示，与非肿瘤组织相比，在原发性前列腺癌样本中，miR-143、miR-145和miR-122表达下调。同样，与正常前列腺上皮细胞PNT2和胚胎肝细胞L-02相比，在前列腺细胞株PC-3和LNCaP中，miR-143和miR-145表达也降低。miR-122在L-02细胞中高度表达，在前列腺癌细胞细胞株中表达也降低。2.2miR-143、miR-145和miR-122的MRE限制外源基因在前列腺癌细胞中的表达实验结果显示，与转染psiCheck2组相比，转染psiCheck2-M3的PNT2中荧光强度被强烈抑制。于此相反，在转染psiCheck2-M3和psiCheck2的前列腺癌细胞中，荧光表达无显著差异。2.3miR-143、miR-145和miR-122的MRE可限制前列腺癌细胞中腺病毒调控的TRAIL表达免疫印迹和ELISA结果显示所有转染Ad-TRAIL的细胞都表达TRAIL蛋白，Ad-TRAIL-M3表达的TRAIL仅在前列腺癌细胞中表达。2.4Ad-TRAIL-M3调控TRAIL表达取决于miR-143、miR-145和miR-122的丰度免疫印迹结果显示，在转染miR-143、miR-145和miR-122抑制剂的L-02细胞中，TRAIL表达部分恢复。而在PC-3细胞中TRAIL表达降低，miR-143、miR-145和miR-122可被miR-143、miR-145和miR-122模拟物上调。qPCR分析显示，miR-143、miR-145和miR-122的丰度，调控转染Ad-TRAIL-M3的L-02和PC-3细胞中TRAIL的表达水平。2.5Ad-TRAIL-M3在对正常细胞没显著细胞毒性的情况下降低前列腺癌细胞的存活率MTT试验显示PNT2和L-02细胞被Ad-TRAIL强烈抑制，但Ad-TRAIL-M3对其没有影响。而Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-M3对前列腺癌细胞都有生长抑制作用。2.6Ad-TRAIL-M3对前列腺癌细胞具有凋亡诱导作用，但对正常细胞没有作用流式细胞仪分析显示，Ad-TRAIL转染后，导致L-02和PC-3细胞G0/G1亚期数升高。而Ad-TRAIL-M3处理仅升高前列腺癌细胞G0/G1亚期数，对正常肝细胞没有影响。免疫印迹分析活化型caspase3和PARP表明，这两个凋亡相关的标志物在转染Ad-TRAIL-M3或Ad-TRAIL的前列腺癌细胞中特异性被活化。2.7Ad-TRAIL-M3对小鼠PC-3移植瘤的生长抑制作用结果显示，Ad-TRAIL-M3可抑制PC-3移植瘤生长达80%左右，Ad-TRAIL-M3和Ad-TRAIL对肿瘤生长的抑制作用没有显著的区别。免疫组化分析肿瘤切片显示，经Ad-TRAIL-M3和Ad-TRAIL治疗后，TRAIL在PC-3移植瘤中广泛表达。2.8Ad-TRAIL-3MRE可保护肝脏不受细胞毒影响尾静脉给予20只正常小鼠注射Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-M3、Ad-EGFP和PBS（n=5），随后收集血样，检测ALT（肝损伤标志物）结果显示，注射Ad-TRAIL的小鼠ALT水平明显升高，Ad-TRAIL-M3、Ad-EGFP和PBS组小鼠ALT水平无变化。此外，免疫组化数据显示，Ad-TRAIL-M3治疗组小鼠肝脏中无TRAIL表达。免疫印迹检测活化PARP显示，Ad-TRAIL-M3可诱导肿瘤凋亡，但对正常肝组织没有影响。3.结论将miRNA反应元件（MRE）miR-143、 miR-145以及miR-122插入腺病毒载体，成功构建Ad-TRAIL-M3腺病毒载体来控制TRAIL的表达，Ad-TRAIL-M3将TRAIL以MRE调控方式表达，从而在前列腺癌中特异性表达高水平TRAIL，通过诱导凋亡抑制前列腺癌细胞的生长，随后在PC-3移植瘤小鼠的研究中，更进一步证明了Ad-TRAIL-M3可抑制肿瘤的生长，而在正常细胞中TRAIL没有表达，不具有细胞毒性，具有较高的生物安全性。