聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种具有重要应用价值的高分子生物聚合物,由于其具有阳离子螯合、吸湿性、水溶性、无毒性和生物可降解性等多种特性,在食品、医药、水处理、化工和农业等领域具有广泛用途。γ-PGA是以谷氨酸单体在的γ-PGA合成酶的催化作用下聚合形成的。近年来,随着微生物生物技术的发展,许多代谢工程策略被应用于γ-PGA高产菌株育种工作中,但是对芽胞杆菌中γ-PGA合成的代谢调控机制研究较少,也没有研究系统解析辅酶和能量工程在γ-PGA高产中的重要作用。为进一步解析地衣芽胞杆菌中γ-PGA合成的代谢调控网络,并通过辅酶和能量工程育种构建γ-PGA高产菌株,进而提高γ-PGA产量。本研究以实验室保存的地衣芽胞杆菌WX-02为出发菌株,首先解析了地衣芽胞杆菌氮代谢全局转录因子TnrA调控y-PGA合成的代谢机制;研究了厌氧转录因子Fnr调控y-PGA合成的代谢机制;通过强化辅酶工程育种,提高了胞内NADPH的供给水平,进而构建了高产γ-PGA的地衣芽胞杆菌工程菌株,提高了 γ-PGA产量;通过能量工程育种,构建了 ATP供给强化工程菌株,并通过组合代谢工程进一步提高了 γ-PGA产量。本研究的主要结论如下:1.地衣芽胞杆菌转录因子TnrA调控聚γ-谷氨酸合成的代谢机制首先,在氮丰富和氮贫瘠条件下,研究了地衣芽胞杆菌中氮代谢转录因子基因tnrA缺失和强化表达对细胞生长的影响,确证了 TnrA主要是在氮贫瘠条件下发挥功能,进而影响菌体的生理代谢。随后,通过研究不同表达水平TnrA对地衣芽胞杆菌中γ-PGA合成的影响,发现TnrA能够负调控γ-PGA的合成,tnrA缺失后γ-PGA提高22%。RT-qPCR结果显示tnrA缺失后y-PGA合成酶基因pgsBCAA的转录水平显著提高。EMSA实验和酶表达实验确证TnrA可以直接负调控pgsBCAA的表达,软件分析和序列比对得到了 TnrA在基因pgsBCAA启动子上的结合位点“CGTCGTCTTCTGTTACA”。最后,通过对NCBI中已报到地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌基因组进行分析,证实了 TnrA调控γ-PGA合成酶基因pgsBCAA的代谢机制在芽胞杆菌中具有高度保守性。本研究验证了地衣芽胞杆菌转录因子TnrA在氮代谢中的重要作用,解析了转录因子TnrA调控γ-PGA合成的代谢机制,并为γ-PGA的代谢工程育种提出了一种新策略。2.地衣芽胞杆菌转录因子Fnr调控聚γ-谷氨酸的代谢机制首先,通过构建地衣芽胞杆菌fnr缺失菌株WXΔfnr,发现在不添加硝酸钠的培养基下,WXΔfnr中γ-PGA产量相比于对照菌株WX-02无明显差别。然而,缺失菌株WXΔfnr在添加硝酸钠的培养基(BFCNA培养基)中的产量只有8.95 g/L,相比于对照菌株WX-02同样条件下的产量(34.53 g/L)下降了 74%。而回补菌株WXΔfnr/pHY-fnr恢复了 γ-PGA的合成能力,Fnr强化菌株WX/pHY-fnr中的y-PGA产量(39.96 g/L)相比于对照菌株WX/pHY300(35.41 g/L)提高了 13%。与此同时,WX/pHY-fnr中硝酸盐代谢水平和ATP合成水平显著提高,说明过表达Fnr可以强化硝酸盐代谢,进而有利于ATP合成和γ-PGA高产。综上,地衣芽胞杆菌转录因子Fnr主要是通过影响硝酸盐代谢来调节γ-PGA合成的,而强化表达Fnr是提高γ-PGA产量的一种有效策略。3.辅酶工程育种促地衣芽胞杆菌WX-02高产聚γ-谷氨酸NAPDH再生水平在目的产物合成代谢中具有重要作用。本研究通过强化NADPH 再生途径中的 6 种关键酶(Zwf、Gnd、Ghd、PntAB、UdhA 和 PpnK),发现强化NADPH再生途径均可以提高地衣芽胞杆菌WX-02中的y-PGA产量,其中Zwf过表达菌株WX/pHY-zwf的效果最为明显,其合成的y-PGA产量为9.13 g/L,相比于对照菌株WX-pHY300(6.74 g/L)提高了 35%,然而其生长速率和糖耗速率却有所降低。与此同时,WX/pHY-zwf中Zwf酶活相比于对照提高了 9.28倍,NADPH浓度及NADPH/NADH比值分别提高了 2.36倍和3.60倍。此外,发酵过程主要副产物乙偶姻/2,3-丁二醇浓度也由于NADH浓度的下降而降低。本研究结果表明通过强化Zwf从而提高NADPH再生水平是提高y-PGA产量的有效策略。4.能量工程育种促地衣芽胞杆菌WX-02高产聚γ-谷氨酸ATP的供给水平在y-PGA的高产具有重要作用。本研究从呼吸链途径优化、引入透明颤菌血红蛋白、强化ATP合成途径及硝酸盐代谢途径出发,以提高细胞内ATP供给水平,进而促进γ-PGA合成。分别开展了以下工作:(1)通过对地衣芽胞杆菌中呼吸链途径优化,敲除了细胞色素bd氧化酶及其ATP结合蛋白基因cydBC,使得菌体维持代谢能降低了 24%,ATP浓度和γ-PGA产量分别提高22%和19%;(2)通过引入透明颤菌血红蛋白(VHB),强化了细胞内的氧气传递水平效率,将ATP浓度和y-PGA产量分别提高了 15%和13%;(3)通过强化ATP合成途径,将细胞内ATP的合成水平提高了 28%,γ-PGA产量提高了 15%;(4)通过研究呼吸型硝酸盐还原酶NarG、同化型硝酸盐还原酶NasC及双组份调控因子ResD～ResE在硝酸盐代谢中的重要作用,得出呼吸型硝酸盐还原酶NarG是地衣芽胞杆菌WX-02中硝酸盐利用的主要酶,而同化硝酸盐还原酶则会影响亚硝酸盐的转化,转录因子ResD则能够调节硝酸盐和亚硝酸盐利用,NarG和NasC的表达都受双组份转录因子ResD～E的调节,强化表达NarG、NasC和ResD均可以提高细胞内ATP供给水平和γ-PGA产量。最后,通过组合代谢工程策略,在cydBC缺失菌株的基础上引入VHB、强化ATP合成和硝酸盐代谢途径进—步提高了细胞内ATP的供应水平(3.53 μmol/g DCW),最终使得y-PGA产量提高至43.81 g/L,相比于出发菌株提高了 39%。本研究结果表明强化细胞内ATP供应水平是提高地衣芽胞杆菌中γ-PGA产量的有效策略。