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细菌在生长过程中合成分泌大量胞外多糖,胞外多糖作为生物膜主要成分参与细菌致病性、抗真菌性、宿主免疫等重要活动。在长期进化过程中,细菌形成一套包含多种酶和转运系统的复杂调控体系参与胞外多糖合成。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的联合固氮菌,在复杂的根际环境中,生物膜的形成有助于该菌根表定殖和竞争优势。前期研究发现,葡萄糖影响生物膜形成,但具体作用机制尚不清楚。本研究通过突变株构建、表型分析、胞外多糖测定及转录组分析等研究工作对葡萄糖刺激A1501胞外多糖合成机制展开研究,取得如下进展:(1)生长曲线测定显示与其它糖类相比,A1501只在葡萄糖中缓慢生长,但生长能力远弱于有机酸和氨基酸,表明葡萄糖是A1501非优势碳源。在正常培养基中添加糖类,结果显示只有葡萄糖可以刺激生物膜形成,并且生物膜促进效应与葡萄糖浓度无关,说明葡萄糖是A1501生物膜形成的环境信号分子。(2)转录组分析葡萄糖诱导下相关基因表达变化,结果显示上调基因186个,主要包括胞外多糖合成、葡萄糖代谢、转运和趋化等相关基因;下调基因75个,主要参与铁转运代谢相关。据此表明在转录水平上葡萄糖诱导胞外多糖形成。(3)利用GC-MS技术检测A1501胞外多糖组分,结果显示A1501胞外多糖组分主要为葡萄糖、甘露糖、核糖、半乳糖以及鼠李糖,同时葡萄糖作用下单糖含量均显著增加,表明葡萄糖可能诱导单糖前体合成。(4)利用qRT-PCR技术分析葡萄糖诱导条件下单糖前体合成关键基因,结果显示葡萄糖可以诱导参与胞内单糖前体GDP-甘露糖、TDP-鼠李糖和UDP-葡萄糖合成的编码基因alg A,rfb D和gal U以及糖基转移酶编码基因psl A表达显著上调。构建相关突变株,表型实验显示四个突变株均失去了葡萄糖刺激效应,表明葡萄糖通过影响胞内alg A,rfb D,gal U和psl A表达,刺激胞外多糖合成和分泌。(5)为了明确葡萄糖刺激胞外多糖合成的方式,本研究对A1501葡萄糖转运系统展开研究。q RT-PCR分析表明葡萄糖作用下Gts ABCD相关基因表达均上调近百倍。gts A突变导致葡萄糖利用能力完全丧失,也不能促进其胞外多糖形成,表明葡萄糖需通过Gts ABCD进入胞内参与A1501胞外多糖合成的调控。综上所述,非优势碳源葡萄糖通过GtsABCD转运系统进入胞内,诱导单糖前体合成编码基因alg A,rfb D,gal U的表达,同时也激活了转运蛋白Psl A,刺激胞外多糖合成,进而有利于生物膜形成。