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1目的基于数据挖掘和miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路,从临床数据挖掘、临床体内观察及体外细胞共培养实验三个方面探讨健脾祛湿清热法改善痛风性关节炎（gouty arthritis,GA）患者免疫代谢炎症反应及心功能变化的科学内涵。2方法2.1数据挖掘研究2.1.1健脾祛湿清热法用药规律与痛风性关节炎患者心功能变化的关联规则分析利用安徽中医药大学第一附属医院（安徽省中医院）住院病历数据处理系统收集2012年6月-2020年6月GA住院患者的病历资料及口服中药资料。分析患者临床指标的变化及处方涉及中药的性味归经情况,探索用药规律。并运用SPSS Modeler 14.1对健脾祛湿清热中药与心功能参数变化进行关联规则分析。2.1.2黄芩清热除痹胶囊改善痛风性关节炎患者心功能变化的数据挖掘研究依据是否使用黄芩清热除痹胶囊（Huangqin Qingre Chubi Capsules,HQC）将患者分为对照组和黄芩组,比较两组之间实验室指标,并采用随机行走模型评价HQC对GA患者的同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP）的影响。2.2临床研究依据纳入及排除标准,收集30例GA患者和30例正常健康人外周血标本,实时定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）检测miR-23a-3p RNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的表达,通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测30例GA患者及30名正常健康人炎症参数IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α。统计分析miR-23a-3p、PTEN、PI3K/AKT/mTOR基因的相对表达量与心功能参数、VAS评分、SF-36等积分值等的相关性。2.3体外实验研究2.3.1 GA患者CD4+T细胞与滑膜细胞共培养收集GA患者外周血并提取CD4+T细胞,滑膜细胞来源于上海赛百慷生物技术股份有限公司。在无菌条件下,按步骤制备MSU结晶培养液,进行对滑膜细胞的进一步刺激。将CD4+T细胞和滑膜细胞放入transwell小室共培养,其中CD4+T细胞在上室,滑膜细胞在下室。运用CCK8、Western blot、RT-qPCR、ELISA等检测方法。2.3.2 GA患者CD4+T细胞与心肌细胞共培养收集GA患者外周血并提取CD4+T细胞,心肌细胞来源于科学细胞研究实验室（美国,加州圣地亚哥,批号:26583）。在无菌条件下,按步骤制备MSU结晶培养液,对心肌细胞的进一步刺激。将CD4+T细胞和心肌细胞放入transwell小室共培养,其中CD4+T细胞在上室,心肌细胞在下室。运用CCK8、IF、Western blot、RT-qPCR、ELISA等检测方法。3结果3.1 1500例GA患者临床数据挖掘研究结果3.1.1 GA患者临床参数的变化治疗前心功能参数EF有14人异常,占总人数的19.44%;LADs有16人异常,占总人数的22.22%;LVDd有12人异常,占总人数的16.67%;SV有7人异常,占总人数的9.72%;BNP有11人异常,占总人数的42.31%;Hcy有75人异常,占总人数的54.35%。和治疗后相比,BNP、Hcy、EF差异具有统计学意义（p<0.05）。hs-CRP、ESR、AAG、WBC、IgA、LgG、IgM、UA、TG差异具有统计学意义（p<0.05）。3.1.2治疗GA的中药用药频次分析1500例使用中药患者进行治疗的处方中共涉及305味中药,出现频率最高的20味中药多集中在健脾祛湿药、清热解毒药、祛风除湿药、活血化瘀药四大类。3.1.3前20味中药与心功能参数关联规则应用关联规则挖掘检测患者心功能参数指标与药物之间的关联,经Apriori模块分析,LADs与黄柏、川牛膝有明显关联;EF与黄柏、川牛膝有明显关联;LVDd与黄柏、川牛膝、土茯苓有明显关联。Hcy与车前草、薏苡仁有明显关联;BNP与川牛膝、薏苡仁有明显关联。3.2 HQC治疗前临床研究结果共计2373例患者符合本研究要求,其中对照组1586例（66.83%）,黄芩组787例（33.16%）。两组实验室指标治疗前后都有变化,对照组中TC、BNP、Hcy差异具有统计学意义（p<0.05）;黄芩组中TC、HDL-C、TG、BNP、Hcy差异具有统计学意义（p<0.01）。两组治疗后实验室指标比较,HDL-C、IgG、TC、TG、Hcy差异具有统计学意义（p<0.05）。随机行走模型评价黄芩组Hcy、hs-CRP较对照组改善显著。3.3GA患者miR-23a-3p、PTEN、PI3K/AKT/mTOR与相关指标的相关性3.3.1两组治疗前后其他实验室指标的变化配对t检验结果显示,与治疗前相比,GA患者临床指标除HDL-C以外均显著降低,其中TG、IgG、TC、Hcy的差异具有统计学意义（p<0.05）。3.3.2 GA患者外周血miR-23a-3p RNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA表达的变化通过RT-qPCR法检测30例GA患者及30名正常健康人miR-23a-3p RNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA。结果显示,发现GA组（除PTEN）均明显高于正常组,PTEN低于正常组,差异具有统计学意义。3.3.3miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR与心功能参数的相关性分析经相关性分析,miR-23a-3p与EF、IVSTd、SV呈正相关（p<0.01）;PTEN与IVSTd呈负相关（p<0.01）;AKT与LADs呈正相关（p<0.01）;mTOR与IVSTd、LVDd呈正相关（p<0.01）。3.3.4 miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR与患者感受参数的相关性分析经相关性分析,miR-23a-3p与关节疼痛VAS、患者对疾病评估VAS、GH、RE、MH呈正相关（p<0.01）;PTEN与SF、RE呈负相关（p<0.01）;PI3K与PF、GH、VT、SF、RE、MH呈正相关（p<0.01）;AKT与PF、SF、RE、呈正相关（p<0.01）。3.4体外实验研究结果3.4.1 HQC干预CD4+T细胞与滑膜细胞共培养3.4.1.1 HQC调节共培养细胞PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平黄芩清热除痹胶囊含药血清的体积分数为20%时其抑制细胞活力的作用最为明显。模型组PI3K、AKT、mTOR的水平较对照组、正常组明显升高,PTEN水平明显下降。HQC降低共培养细胞PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平,提高PTEN蛋白水平。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平,提高PTEN蛋白水平。3.4.1.2 HQC调节共培养细胞miR-23a-3p RNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平RT-qPCR结果显示,模型组miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的水平较对照组、正常组明显升高,PTEN mRNA水平明显下降（P<0.01）。HQC降低共培养细胞miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平,提高PTEN mRNA水平（p<0.01）。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平,提高PTEN mRNA水平（p<0.01）。3.4.1.3 HQC降低共培养细胞细胞因子水平ELISA结果显示,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平较对照组、正常组明显升高,IL-10水平明显下降（p<0.01）。HQC干预下IL-1β、IL-6、TNF-α明显下降,而IL-10的表达明显上升（p<0.01）。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低IL-1β、IL-6、TNF-α明显下降,提高IL-10水平（p<0.01）。3.4.2 HQC干预CD4+T细胞与心肌细胞共培养3.4.2.1HQC改善心肌细胞的心肌特异性标志物不同体积分数的（5%、10%、20%）黄芩清热除痹胶囊含药血清对心肌细胞作用24 h、48h、72h后,与对照组比较,黄芩清热除痹胶囊含药血清的体积分数为20%时其抑制细胞活力的作用最为明显。蓝色荧光反映细胞核,绿色点状或块状荧光斑是BNP、Connexin 43、Tn I、Tn T,从Merge可见BNP、Connexin 43、Tn I、Tn T均匀分布于心肌细胞核内。其中可见F组心肌细胞BNP、Connexin 43、Tn I、Tn T荧光斑荧光增强的现象最强烈,在心肌细胞内的分布变得紊乱。而A组及B组心肌细胞有荧光减弱甚至缺失的现象,D组及G组在加药后与C组及F组的各自比较荧光斑荧光明显减少。3.4.2.2 HQC调节共培养细胞PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平黄芩清热除痹胶囊含药血清的体积分数为20%时其抑制细胞活力的作用最为明显。HQC降低共培养细胞PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平,提高PTEN蛋白水平。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平,提高PTEN蛋白水平。3.4.2.3 HQC调节共培养细胞miR-23a-3p RNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平RT-qPCR结果显示,模型组miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA的水平较对照组、正常组明显升高,PTEN mRNA水平明显下降（P<0.01）。HQC降低共培养细胞miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平,提高PTEN mRNA水平（p<0.01）。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低miR-23a-3p RNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA水平,提高PTEN mRNA水平（p<0.01）。3.4.2.4 HQC降低共培养细胞细胞因子水平ELISA结果显示,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平较对照组、正常组明显升高,IL-10水平明显下降（p<0.01）。HQC干预下IL-1β、IL-6、TNF-α明显下降,而IL-10的表达明显上升（p<0.01）。过表达miR-23a-3p后,HQC同样可以不同程度降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平,提高IL-10的表达水平（p<0.01）。4结论4.1 GA患者体内存在着免疫代谢炎症反应的紊乱并出现心功能变化状态,健脾祛湿清热法对其具有良好的效果。4.2 HQC在改善GA患者临床症状的同时,还能够显著改善GA患者心功能变化状态,并且在临床疗效及改善心功能变化状态的疗效上优于对照组。4.3 GA患者细胞因子、心功能参数、miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路与正常健康人之间存在明显差异。GA患者体内异常的心功能参数变化与免疫炎症代谢反应、细胞因子失衡、miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常活化直接相关。4.4 HQC改善GA患者炎症反应状态及心功能变化的机制如下:4.4.1HQC通过上调抗炎细胞因子（如IL-10）、下调促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）,控制炎症反应,恢复机体的平衡,从而改善临床症状。4.4.2HQC通过刺激miR-23a-3p下调,然后调控PTEN上调,下调PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达,改善患者炎症状态,从而达到改善患者关节炎症变化状态的效果。4.4.3HQC通过刺激miR-23a-3p下调,然后调控PTEN上调,下调PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达,改善心肌细胞炎症状态,从而达到改善患者心功能变化状态的效果。