一、前言软骨发育不全(achondroplasia,ACH)是长期困扰临床工作者的一种软骨代谢类疾病,主要表现为四肢短小的,颅面畸形,而脊柱的长度往往正常。早在1906年Rankin等人就以科学的视角报道了软骨发育不全的病例。而在1968年和1979年中,Langer和Oberklaid分别对ACH的影像学表现做了深入的报道,由此以后关于ACH的研究不断深入。从目前的研究成果来看,ACH是一种常染色体显性基因突变的遗传病,一般在儿童时期就能被发现,由于本病是染色体突变的结果,治疗措施缺乏,而软骨作为人体广泛存在且非常重要的组织,一旦发育紊乱,会累及多个系统和器官,故临床上预后较差。Oberklaid等人通过测量ACH患者的全身多处影像学指标后得出的该疾病的临床表现大体可以概括为:出生时患儿的躯干与四肢不成比例,头颅大而四肢短小,但常有躯干长度接近正常,表现为短肢型侏儒症。此外,肢体近端受累甚于远端,如股骨较胫、腓骨,肱骨较尺、桡骨更为短缩,这一特征随年龄增长愈加明显,以后逐渐形成侏儒畸形。此外,面部特征表现为鼻梁塌陷、下颌突出以及前额宽大。中指与环指不能并拢,呈典型的“三叉戟手”。可有肘关节屈曲挛缩及桡骨头脱位,下肢短而弯曲呈弓形,肌肉尤显臃肿。脊柱长度接近正常,但在婴儿期即可有胸椎后凸畸形。婴儿期枕骨大孔狭窄在患儿中也比较常见,主要症状为腰腿痛及间歇性跛行。智力一般不受影响。引起ACH的病因很多,目前仍然没有比较统一的观点,但是成纤维生长因子受体3(Fibroblast growth factor receptor,Fgfr3)基因突变会常常会导致短肢型侏儒症。另外Fgfr1,Fgfr2,Twist1以及Spred-2等基因的突变也可导致软骨发育不全。经典的理论认为,长骨末端生长板周围的软骨组织的细胞主要分为4层,在股骨远端生长板周围由远端至近端包括:静息区细胞,增殖区细胞,肥大前区细胞和肥大区细胞(附图1a)。静息区细胞主要处在静息状态,为增殖区细胞的前体细胞,主要表达SOX9,2型胶原(Col2),Ptch1(Ihh靶分子)等信号分子;增殖区细胞又叫柱状层细胞,即大量细胞处于增殖状态,主要表达Ptch1,FGFR3,NKX3.2等信号分子;而肥大前区细胞主要是在增殖区末端向软骨细胞分化的未完全成熟的细胞,主要表达Ihh,PPR,BMP6,AKP,RUNX2,OSX等信号分子,而肥大区细胞是成熟的软骨细胞,主要表达10型胶原(ColX)等信号分子,除此之外,不少人还将介于肥大细胞和成骨细胞间的细胞层定义为终末肥大区细胞,即软骨细胞退化凋亡,软骨基质钙化,成骨细胞长入的部位,其主要表达OPN(骨桥素),此后成骨细胞参与骨小梁的形成,软骨基质被矿化骨替代。此外,由静息区到肥大前区的细胞都表达2型胶原(Col2),由此研究人员常常将2型胶原视作软骨细胞的标志性蛋白。调控长骨远端生长板周围的软骨各层细胞的正常生理活动的因子很多,其中最重要的生长因子包括:PTHrP和Ihh,以及由上述两种因子参与形成的PTHrP/Ihh信号通路(附图1c)。作为调控软骨细胞最重要的信号通路,PTHrP/Ihh信号通路在软骨组织的4层细胞中有着十分有趣的特点,主要表现为PTHrP的含量从静息区细胞到终末肥大区细胞依次递减,而Ihh恰好相反,从静息区细胞向终末肥大区细胞依次递增(附图1c),这样的特点可能是由于两种蛋白所调控的生理功能不同造成的,PTHrP主要是抑制细胞分化,维持细胞处于静息状态,所以在静息区表达最高,而Ihh是促进细胞分化,抑制细胞分裂,因此Ihh在肥大前区高表达。此外,各个层面的软骨细胞生长因子表达还各具特点:在静息区的最远端细胞中往往高表达PTHrP,而在静息区细胞的中段及近端往往表现为低表达的Ptchl,而增殖区细胞往往高表达Ptchl,肥大前区细胞表达Ihh,而终末肥大区往往表达ColX比较多(附图lb)。由此不难看出PTHrP往往是抑制Ptchl的表达,而Ptchl是促进增殖区细胞增殖的重要调控因子。另外,Ihh是促进软骨分化的重要调控因子,而ColX胶原是衡量软骨细胞成熟的关键蛋白,对软骨细胞的成熟分化同样起着正性调节的作用。另外,PPR作为PTHrP的受体,主要在肥大前区表达,而肥大前区主要还是Ihh表达以及一些低表达的PTHrP。除此之外,静息区细胞旁分泌的PTHrP会抑制增殖区细胞向肥大区细胞转化,此过程主要是由PPR介导,由此不难看出PTHrP的受体PPR,在抑制增殖区细胞的分化过程中起着举足轻重的作用。mTOR信号通路主要调控细胞的增殖、分化以及凋亡等重要的代谢活动,目前发现两个亚型:mTORC1和mTORC2。mTOR信号通路在软骨代谢疾病中的作用已被大量证实,首先mTOR能调控软骨细胞的增殖和凋亡,从而对软骨肉瘤、骨关节炎、软骨发育不良等疾病有重要影响,此外,mTOR还调控炎症因子的表达,因此对自身免疫性关节炎疾病也作用广泛。目前由于mTORC1信号通路(附图2)信号通路的特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)的发现,加深了人们对mTORCl信号通路的认识,丰富了对mTORC1通路的了解。小 G 蛋白 Rheb(Ras homolog enriched in brain,Rheb)是 mTOCl 的重要组件(附图2),最初在神经细胞中被发现,后来在其他细胞中陆续有报道,目前发现的Rheb蛋白包括两种亚型:Rhebl和Rheb2。目前已经了解的Rheb的主要功能是和Tscl/2复合体信号组件(附图2)一起,参与到调控mTORCl信号通路的活性中来,Rheb起着正性调控的作用,而Tscl/2则负性调控mTORCl信号通路的活性。因此,在一定程度上讲,Rheb通过调控mTORCl信号通路从而参与到调控细胞的增殖,分化,凋亡,炎症等生理活动中来。P-S6(附图2)作为mTORC1信号通路的下游蛋白,主要通过促进核糖体蛋白的合成来增加蛋白质的合成,从而最终促进细胞内各种新陈代谢活动,是mTORC1行使生理功能的重要信号分子,在实际的研究过程中,人们往往通过检测P-S6的表达量来衡量mTORCl的活性,因此,不难看出P-S6是mTORCl中非常重要的蛋白因子。二、目的为了从基因水平探讨Rheb在软骨细胞中的功能以及重要性,我们选择了说服力强,特异性和敏感性都非常高的Cre/loxp介导的基因打靶技术来探究此问题。本研究通过终生在软骨细胞特异性敲除Rheb,并运用高分辨率CT(high-resolution CT,μ-CT)扫描、免疫组化(immunohistochemical,IHC)染色,组织学检测(histological assay),番红 O-快速绿染色(safranin O-fast green staining),蛋白免疫印迹(westernblotting,WB)等技术手段,了解小鼠出生后3天,7天,10天,14天,21天后小鼠的宏观大体表现、长骨远端的微观骨显微结构、股骨远端生长板周围软骨的组织学表现以及软骨细胞中相关的蛋白因子表达,探究Rheb在软骨细胞中的作用以及体内软骨细胞缺失Rheb会出现何种病理表现,为临床诊断软骨发育相关疾病提供新颖的手段,为治疗软骨发育不全提供药物靶点。三、材料和方法1、软骨细胞特异敲除Rheb基因小鼠的构建表达II型胶原-cre重组酶(Co12α-cre)的转基因工具小鼠购至杰克森实验室(Jacksonlab,美国),Rhebloxp/loxP(Rheb-/-)转基因小鼠由四川大学华西医学院华西临床医学院神经发育与代谢研究室肖波教授馈赠。选取8周大的Rheb-/-雄性C57/BL6遗传背景小鼠与8周大的Co12α-cre雌性C57/BL6遗传背景小鼠杂交得到第一代(F1)子代小鼠,从F1代小鼠中通过基因型鉴定挑选出Rheb+/--cre小鼠,当F1代Rheb+/--cre小鼠长到8周大时,用8周大Rheb-/-异性小鼠回交得到第二代(F2)子代小鼠,从F2代小鼠中通过基因型鉴定挑选出Rheb-/-cre小鼠,即为我们需要的转基因敲除小鼠,标记为KO组,而F2代以后出生的同窝小鼠中,Rheb-/-·小鼠,Col2α-cre小鼠,Rheb+/-A-cre小鼠作为对照小鼠,标记为WT组,此后的合笼原则均遵循F2代的合笼策略,即Rheb+/--cre小鼠与异性的Rheb-/-小鼠交配,不断得到我们所需要的Rheb-/--cre目的小鼠,F1代及其以后的小鼠均通过基因型鉴定技术(Genotype identification technology)筛选出来,Rheb在子代小鼠中的重组符合孟德尔杂交规律(Mendel’s laws of hybridization)。另外,我们对出生24小时以内的KO和WT小鼠的肋软骨进行了WB检测,了解Rheb和它的下游蛋白磷酸化核糖体S6蛋白(phosphorylation ribosomalS6,P-S6)的表达量,从而在蛋白水平验证Rheb基因的敲除效果。2、Rheb基因在小鼠软骨发育中的作用研究取在标准环境下饲养的小鼠30只,分别为出生3天、7天、10天、14天、21天的敲除鼠(Knockoutmice,KO)和同窝对照鼠(Wildtypemice,WT),每组各3只,腹腔过量注射戊巴比妥钠处死。首先对小鼠进行大体图像拍照,体重及各重要脏器和组织的重量称量,体长以及身长、尾长、股骨长度和鼻部长度数据测量,然后取下动物下肢,对小鼠膝关节进行H&E染色(Hematoxylin and eosin staining,H&E staining),番红O-快速绿染色(SafraninO and fast green staining),免疫组织化学染色(Immunohistochemistry staining,IHC)以及对出生3天的小鼠肋软骨进行蛋白免疫印迹(Western bloting,WB)检测。H&E染色用统计股骨下段软骨细胞各细胞层的细胞数(Cell number,CL#),番红O-快速绿染色统计作色区域大小(Aera),IHC统计各蛋白的平均表达强度(Mean optical density,MOD),WB测量各蛋白的灰度值(Gray value,GV)后计算出蛋白表达改变倍数(Foldchange),以上所有定量结果均使用Image-Pro Plus(IPP,美国)进行测量。明确在Rheb基因缺失的情况下,对小鼠体重的增长,体长的生长,长骨远端生长板周围软骨细胞的蛋白表达的影响。3、Rheb基因在小鼠骨代谢发育中的作用研究取21天出生的KO组小鼠和WT小鼠的股骨标本做显微CT(Micro-CT,μCT)扫描和三维重建,了解Rheb基因敲除对小鼠股骨远端骨显微结构的影响,并对小鼠股骨下段进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP),了解Rheb缺失对小鼠股骨远端的破骨细胞的影响。显微CT扫描设置的参数为:扫描电压70KV,功率为30 W,扫描电流为429 μA,每次扫描厚度为20 μm。扫描后分析的骨代谢参数包括以下几种:骨小梁厚度(Tb.Th);BMD和骨小梁数量(Tb.N)。TRAP染色用IPP软件统计阳性细胞的个数(osteoclast number,OC#),用以明确软骨细胞敲除Rheb对股骨远端成骨作用和破骨作用的影响。四、结果1、软骨细胞特异敲除Rheb基因小鼠的构建对出生后3天的小鼠进行基因型鉴定,发现KO小鼠鼠尾中的DNA样品中Rheb基因所在的染色体以及等位染色体上均含有loxp片段,聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)产物全都在850bp;而只有一个Rheb基因插入loxp片段的小鼠PCR产物一部分在800bp,另一部分在850bp;而Rheb中没有loxp片段的小鼠鼠尾中DNA的PCR产物全在800bp;此外,鼠尾DNA中含有Col2-cre的PCR产物在500bp中会有一个条带。这提示我们在Rheb-/--cre小鼠中ere酶阳性的细胞,Rheb基因的敲除是完全的,因此我们得出初步判断Rheb-/--cre小鼠的软骨细胞在基因水平上已经完全敲除Rheb;此外在出生24小时以内的KO和WT小鼠的肋软骨中,我们通过WB检测发现Rheb蛋白表达的缺失,从蛋白水平验证了 Rheb-/--cre小鼠的基因敲除效果,另外我们同时还检测了 Rheb下游蛋白P-S6表达,并出现明显差异,和WT组小鼠相比,KO组小鼠的P-S6表达下降非常明显,从另一个侧面提示我们在Rheb基因敲除的情况下,P-S6的表达是明显被抑制的,但是在正常情况下,Rheb蛋白参与合成P-S6,Rheb表达的下降将明显抑制P-S6的表达。因此我们从基因水平和蛋白水平验证了 Rheb-/--cre小鼠的基因敲除效果,为我们下一步的实验提供了良好的依据。此外我们发现在出生后3～21天的小鼠中,KO组小鼠和WT组小鼠相比,体重明显下降,并且脂肪组织、心、肝、脾、肺、肾、脑及骨架的重量均下降;但脂肪组织、心、肝、脾、肺、肾、脑的重量与体重的比值在KO组和WT组中没有明显差异,但是KO组中骨架与体重的比值明显低于WT组。以上信息提示我们Rheb基因敲除鼠中重量下降最明显的应该是骨骼部分,而Rheb基因的缺失导致小鼠骨骼发育功能低下。另外,通过对各组小鼠的体长测量我们发现,和WT组小鼠相比,KO组小鼠的在3～21天中的体长均比WT组要短:此外我们发现3～21天KO组的尾长也比相应的WT组要短,并且随着小鼠从7天到21天的发育过程中,我们发现KO组小鼠的面颅的鼻梁长度也相应比WT组明显缩短;最后在3～21天的KO组小鼠中我们发现小鼠的股骨长度明显短于WT组,在21天是差异最明显。因为软骨组织大量分布在小鼠的椎体骺板,以及四肢长骨的生长板周围和鼻部,所以不难得出小鼠全身软骨细胞敲除Rheb基因对小鼠软骨组织的发育的抑制作用。2、Rheb基因在小鼠软骨发育中的作用研究我们通过股骨下段H&E染色发现,在3～21天出生的小鼠中,与WT组小鼠相比,KO组小鼠的生长板周围软骨细胞的排列杂乱,软骨各层之间的界限不清晰,通过对股骨下段生长板周围H&E染色的软骨细胞定量结果发现,各个层面的软骨细胞数量均明显减少,尤其以柱状层软骨细胞减少最为厉害,提示我们软骨细胞广泛敲除Rheb对生长板处的软骨发育抑制作用明受影响最为剧烈,增殖区细胞主要负责软骨细胞前体细胞的增殖和分裂,在哺乳动物长骨的长长过程中起着至关重要的作用,如果机体处于发育期,增殖区细胞会通过不断增殖为长骨的生长和软骨内成骨提供源源不断的细胞,相反,如果软骨细胞增殖区发育迟缓或受到明显抑制,可能会引起机体出现短肢型侏儒症的;在3～21天的小鼠股骨的番红O-快速绿染色上我们得到的结论和H&E染色相似,从另一个角度证明了我们的发现,首先在KO组小鼠的股骨下段生长板周围的软骨细胞的细胞数量是明显变少的,软骨发育收到抑制,但以增殖区尤其明显,其次是通过对番红O着色区域的检测我们能大体判断小鼠的生长板周围的软骨量,和WT组小鼠相比,KO组在生长板周围的软骨量也是明显下降的。为了探讨引起KO组小鼠软骨发育中增殖区细胞明显减少以及软骨量降低的原因,我们对股骨远端生长板周围进行了免疫组化(IHC)实验,以及取新生鼠的肋软骨蛋白样品进行蛋白免疫印迹(WB)实验。IHC的结果是在21天的小鼠膝关节的生长板周围,甲状旁腺激素相关多肽受体(PTHrPreceptor,PPR)的表达量是明显降低的,而PPR是甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid Hormone Related Protein,PTHrP)的受体,主要在肥大前区表达,而PPR的表达会直接促进增殖区细胞的生理功能的实现,即促进增殖区细胞增殖,此外我们通过3天小鼠的肋软骨蛋白免疫印迹实验发现在KO小鼠的肋软骨中,印度刺猬蛋白(Indian hedgehog protein,Ihh)’和10型胶原(ColX)的量也是明显减少的,这主要提示我们在KO组小鼠的软骨细胞中,由于Rheb的缺失导致了Ihh和ColX的表达降低。3、Rheb基因在小鼠骨代谢过程中的作用研究首先,我们在3～21天的小鼠H&E染色中我们发现,和WT组相比,位于KO组小鼠的生长板下的骨小梁排列稀疏,骨小梁和骨皮质的厚度变薄,这提示我们在KO组小鼠中存在着骨质疏松的表现,可能是由于Rheb基因在软骨细胞敲除后导致软骨细胞合成和分泌蛋白质的功能下降,新陈代谢减慢,增殖区细胞增殖变缓,引起软骨内成骨减少,最终导致股骨下段骨质疏松。另外,我们通过对出生后21天的小鼠的股骨下段进行μCT扫描发现,和WT组小鼠相比,KO组小鼠的骨小梁数量(TrabecularNumber,Tb.N)明显减少,骨矿物含量(Bone Mineral Density,BMD)明显降低,骨小梁之间分离度(Trabecularseparation,Tb.Sp)明显增加,进一步提示我们KO组小鼠存在着骨质疏松,而软骨细胞敲除的Rheb基因可能是引起KO小鼠骨质疏松的重要原因。另外我们对出生后21天小鼠的股骨下段进行了TRAP染色发现,在生长板两侧的骨小梁周围,破骨细胞的数量是明显减少的,从而提示我们在软骨细胞敲除Rheb对破骨细胞起着抑制作用。由此我们不难看出,软骨细胞特异敲除Rheb对骨代谢起着抑制作用,不光抑制成骨,还抑制破骨作用。五、结论小鼠软骨细胞上敲除Rheb基因会出现短肢体型侏儒症,主要表现为软骨发育不全,并伴有骨质疏松,此过程发生的原因是由于软骨细胞中Rheb基因的缺失,导致P-S6水平的下降,引起指导蛋白质合成的核糖体蛋白磷酸化蛋白减少,相关代谢活动减慢,PPR、Ihh以及ColX分泌的减少引起软骨增殖区细胞增殖减慢,软骨的成熟分化过程也同样收到抑制,最终导致肥大前区和肥大区细胞由于增殖区提供的细胞来源不足,以及本身分化能力减弱,出现的软骨发育迟缓和软骨内成骨减少,从而在大体表现上出现长骨生长变缓,短肢型侏儒症和股骨下段骨质疏松。本研究意义可为临床上ACH患者的病因诊断提供有力的基础实验依据,为ACH以及ACH合并骨质疏松的患者的治疗提供可能的药物靶点。