一、研究背景与目的 生物治疗(biotherapy)是继手术、化疗、放疗后肿瘤的第四大治疗模式。而生物化疗(biochemotherapy)又是生物治疗中很有发展前景的治疗方法之一，它是生物治疗(biotherapy)和化学治疗(chemotherapy)联合应用于肿瘤防治的一种全新的综合治疗模式，是生物治疗和化学治疗的有机结合。目前研究发现，晚期乳腺癌中约20％～30％患者伴有HER-2/neu的过度表达，该类患者疾病发展快，预后差，对化疗及三苯氧胺抗拒，缺乏有效治疗手段。随着对肿瘤发生发展的分子机制深入研究和生物技术的发展，以HER-2/neu作为治疗靶点，阻断受体介导的肿瘤细胞增殖，成为晚期乳腺癌治疗的研究方向。赫赛汀(Herceptin)就是目前针对肿瘤细胞表面HER-2/neu蛋白靶向治疗的人鼠嵌合型单克隆抗体，1998年被美国FDA批准上市，可作为HER-2/neu过度表达晚期乳腺癌的治疗药物之一。但因其抗肿瘤活性并非是直接通过细胞毒性所介导，因此单药有效率并不高，约为12％～24％。目前，赫赛汀(Herceptin)除了作为二线或三线单药使用外，大量临床试验和临床应用将其作为一线药物与化疗联用，并证明其与细胞毒性药物联合应用可产生更好的临床疗效，都优于单用赫赛汀或单用化疗，同时可以改善患者的生存质量。由于Herceptin与化疗药物联合应用带来了较好的的临床效果，故本实验进一步将其与传统化疗药物序贯联合应用来进行研究，寻求最佳的用药方式，达到最大限度杀灭肿瘤细胞的目的。 本研究旨在：1、探讨Herceptin与doxorubicin(多柔比星)序贯应用对乳腺癌细胞株BT-474的杀伤效应及对其HER-2/neu表达率及平均荧光强度的影响；2、探讨Herceptin与doxorubicin序贯应用当其中一种发生浓度梯度变化时，对乳腺癌细胞株BT-474的杀伤效应；3、用药前后光学显微镜高倍和低倍下观察不同用药组及对照组细胞形态及内部结构的变化。 二、材料和方法 (一)材料 RPMI-1640培养液、10％胎牛血清(FCS)、2mMol/LL-谷氨酰胺溶液、50％葡萄糖溶液、1mMol/L丙酮酸钠溶液、10mg/L牛胰岛素、0.25％胰蛋白酶、0.04％EDTA溶液、Herceptin(赫赛汀)、doxorubicin(多柔比星)、0.01Mol/LPBS缓冲液(pH7.4)、AnnexinV-FIFC试剂盒、HER-2高表达的人乳腺癌BT-474细胞系、流式细胞仪、超净工作台、NAPCOMODEL5410型二氧化碳电热恒温箱、SiGMal-13型离心机、LSY-Ⅱ型普通离心机、Nikon倒置显微镜及相机、γ闪烁计数仪、烤箱、YX-280型手提式压力蒸汽消毒器、96孔培养板、天平、微量可调加样器。 (二)方法 乳腺癌BT-474细胞培养于含10％FCS的RPMI-1640溶液中。待乳腺癌细胞长至对数生长期，用24孔板培养BT-474细胞，每孔细胞数为2×105，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，镜下观察细胞呈贴壁生长后，进行以下实验。 1)药物浓度不变时对细胞的杀伤效应。分doxorubicin组、Herceptin组、先doxorubicin后续应用Herceptin组、先Herceptin后续应用doxorubicin及空白对照共5组，每组为5复孔。光学显微镜下观察各组细胞用药前后细胞形态的变化，流式细胞仪(FACS)检测用药后各组细胞HER-2/neu的表达率、HER-2/neu表达的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)及各组细胞的死亡率。 2)当Herceptin发生浓度梯度变化时对细胞的杀伤效应。分先Herceptin后续应用doxorubicin和先doxorubicin后续应用Herceptin两大组，每大组根据Herceptin浓度分为75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml及空白对照共5小组，流式细胞仪(FACS)检测各组细胞的死亡率。 3)当doxorubicin发生浓度梯度变化时对细胞的杀伤效应，分先Herceptin后续应用doxorubicin和先doxorubicin后续应用Herceptin两大组，每大组根据doxorubicin浓度又分为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml及空白对照共6小组，流式细胞仪(FACS)检测各组细胞的死亡率。 4)实验结果以“均数±标准差”表示，利用SPSS10.0软件对各结果进行处理。其中，用药后各组细胞HER-2/neu表达的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)采用样本均数间多重比较的LSD法、各组细胞的死亡率采用样本均数间多重比较的Tambane’sT2法、Herceptin或doxorubicin发生浓度梯度变化时各组细胞的死亡率采用析因设计资料的方差分析，Herceptin或doxorubicin发生浓度梯度变化而不同用药方式组细胞死亡率采用独立样本t检验。限定P≤0.05为差异有统计学意义。 三、结果 光学显微镜下各用药组细胞均有不同程度的变暗、细胞碎片增多、细胞外形部分不规则、细胞内颗粒增多等；流式细胞仪检测表明各组间细胞表面HER-2/neu表达率无显著性差异，但各用药组细胞HER-2/neu表达的平均荧光强度明显低于对照组(P＜0.001)；流式细胞仪检测表明各用药组细胞间的死亡率明显高于对照组(P＜0.05)，当Herceptin发生浓度递增变化时，无论是先Herceptin后续应用doxorubicin组还是先doxorubicin后续应用Herceptin组，两大组中均除了75ug/ml与150ug/ml两小组间细胞死亡率无显著性差异外(P=0.2)，其余各组间细胞的死亡率均有显著性差异；当doxorubicin发生浓度递增变化时，无论是先Herceptin后续应用doxorubicin组还是先doxorubicin后续应用Herceptin组，两大组中均除了15ug/ml与20ug/ml两小组间细胞死亡率无显著性差异外(P=0.946)，其余各组间细胞的死亡率均有显著性差异。在任何同一浓度组，Herceptin后续应用doxorubicin组与doxorubicin后续应用Herceptin组之间细胞死亡率均有显著性差异(P=0.014)。 四、结论 1、不管是单独用药还是联合用药(Herceptin与doxorubicin)，均不会降低乳腺癌BT-474细胞表面HER-2/neu表达率。 2、不管是单独用药还是联合用药(Herceptin与doxorubicin)，均会导致乳腺癌BT-474细胞表面HER-2/neu的平均强度表达下降。 3、当Herceptin发生浓度梯度变化时，除了75ug/ml与150ug/ml两小组细胞死亡率无差别外，其余各组的细胞死亡率均随着药物浓度的增加而增加，而各组细胞的晚期凋亡率却逐渐下降。 4、当doxorubicin发生浓度梯度变化时，细胞的死亡率并不随着doxorubicin浓度的增加而逐渐升高，反而逐渐下降，但各组细胞的晚期凋亡率却逐渐上升。 5、多组实验表明，应用Herceptin后再辅以doxorubicin化疗，对乳腺癌细胞杀伤效应最强，为临床乳腺癌及其它肿瘤生物化疗的序贯应用模式提供了实验依据。