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目的:Sonic hedgehog（Shh）是一种进化上高度保守的形态因子,其成熟、运输和功能与胆固醇密切相关,血管内皮细胞损伤和脂质浸润在动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的形成和进展中发挥重要作用,然而,有关Shh对氧化性低密度脂蛋白（Oxidative low density lipoprotein,ox-LDL）诱导的内皮细胞损伤以及动脉粥样硬化的影响,目前尚未有研究报道。本研究分析了前期实验的AS小鼠主动脉组织基因芯片,观察Hedgehog通路分子表达;在体外通过ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）建立细胞损伤模型,探讨Shh在内皮细胞损伤中的作用及分子机制;采用高脂喂养载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E knockout,ApoE-/-)小鼠构建AS模型,观察Shh对动脉粥样硬化斑块等的影响,为找寻防治AS提供新的靶点,发掘Shh可能的临床应用价值。方法:1.通过动脉粥样硬化小鼠主动脉基因芯片分析差异基因,KEGG及基因富集分析,观察Hedgehog信号通路的表达。为进一步验证基因芯片分析结果,通过高脂喂养构建ApoE-/-小鼠AS模型,以及ox-LDL诱导建立HUVECs损伤体外模型,实时定量聚合酶链反应（Real-Time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）及蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测Hedgehog家族成员Shh、Ihh和Dhh的表达,对基因芯片结果进行验证。2.在HUVECs中,Shh基因过表达质粒（plasmid encoding human Shh gene,phShh）、Shh重组蛋白（recombinant Shh protein,rShh）和Shh小干扰RNA（Shh siRNA）预处理后,ox-LDL刺激24 h,观察过表达和沉默Shh对内皮细胞损伤的影响。通过DCFH-DA检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的浓度和Griess试剂检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）的表达,RT-qPCR检测内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecules,ICAM-1）和血管黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1）mRNA的表达,WB检测Bcl-2、Bax和Cleaved caspase 3蛋白的表达,流式检测细胞凋亡。3.采用蛋白质免疫共沉淀法（Co-IP）观察Shh蛋白和NF-κB p65蛋白的结合情况,通过WB法,检测Shh干预后的IKKα/β、IκBα和NF-κB p65蛋白磷酸化的变化,蛋白核质分离检测Shh对NF-κB p65活性的变化。4.构建ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型,Shh慢病毒载体干预。根据实验目的随机分为（1）正常饮食组（Chow组）,（2）高脂饮食组（High fat diet,HFD组）,（3）HFD+慢病毒对照组（NC组）,（4）HFD+Shh过表达慢病毒组（Lv-Shh组）,（5）HFD+Shh-sh RNA慢病毒组（Sh-Shh组）。慢病毒通过尾静脉注射到给予高脂饮食的ApoE-/-小鼠体内,注射慢病毒2×10~7TU/只,观察12周后,处死小鼠,分离获得小鼠血清和主动脉组织。观察HFD和Shh对小鼠体重和血脂的影响;大体油红O染色检测主动脉粥样斑块大小;检测主动脉组织中eNOS表达和血清中NO的含量,观察Shh对血管收缩舒张功能的影响;检测小鼠肺干湿重,观察Shh对内皮损伤和渗透性的影响;RT-qPCR检测ICAM-1和VCAM-1的表达,观察小鼠主动脉血管炎症变化。结果:1.基因芯片分析提示,在动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中Hedgehog信号通路表达下调。进一步验证基因芯片结果,与正常饮食组相比,高脂饮食组ApoE-/-小鼠主动脉组织中Shh、Ihh和Dhh表达下调,在体外,随着ox-LDL浓度的增加,Shh、Ihh和Dhh的表达逐渐下调,表明在动脉粥样硬化及ox-LDL诱导的内皮损伤中,Shh通路分子表达均下调。2.Shh基因过表达质粒（phShh）、Shh重组蛋白（rShh）和Shh siRNA处理HUVECs后,ox-LDL刺激24 h,结果显示（1）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh抑制ROS表达,Shh siRNA促进ROS表达。（2）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh促进eNOS和NO表达,Shh siRNA抑制eNOS和NO表达。（3）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh抑制ICAM-1和VCAM-1表达,Shh siRNA促进ICAM-1和VCAM-1表达。（4）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh促进Bcl-2表达和抑制Bax表达,上调Bcl-2/Bax比值。（5）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh抑制Caspase 3活性和Cleaved caspase 3表达,减少细胞凋亡。以上结果初步显示,激活Shh可以减少ox-LDL诱导的内皮氧化应激,炎症反应和线粒体介导的细胞凋亡,改善内皮细胞功能。3.Shh与NF-κB信号通路的关系:（1）蛋白质免疫共沉淀法证明Shh蛋白与NF-κB p65蛋白存在相互作用。（2）与ox-LDL处理组相比,质粒phShh和重组蛋白rShh抑制IKKα/β、IκBα和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平。（3）与ox-LDL处理组相比,重组蛋白rShh减少细胞核中NF-κB p65蛋白水平,抑制NF-κB p65核转位。提示Shh很可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活,发挥保护内皮细胞损伤和抑制凋亡作用。4.ApoE-/-小鼠经高脂饮食和慢病毒干预处理后:（1）与Chow组相比,HFD组体重增加,血清中T-CHO、TG和LDL-C上调,HDL-C下调。高脂喂养的ApoE-/-小鼠,包括HFD组、NC组、Lv-Shh组以及Sh-Shh组各组小鼠体重和血脂水平差异不存在统计学意义。（2）主动脉大体油红O染色显示,与Chow组相比,HFD组斑块面积显著增加。与慢病毒对照组相比,小鼠主动脉斑块面积在Lv-Shh组明显减少,Sh-Shh组明显增加。（3）高脂饮食下调血清NO水平,抑制主动脉组织eNOS的表达。与慢病毒对照组相比,Lv-Shh组eNOS和NO合成增加,Sh-Shh组eNOS和NO合成减少。（4）高脂饮食诱导小鼠肺湿重增加,肺湿/干重比值上调。与慢病毒对照组相比,Lv-Shh组小鼠肺湿重和肺湿/干重比值下调,Sh-Shh组肺湿重和肺湿/干重比值上调。（5）高脂饮食诱导小鼠主动脉组织ICAM-1和VCAM-1表达。与慢病毒对照组相比,Lv-Shh组ICAM-1和VCAM-1表达下调,Sh-Shh组ICAM-1和VCAM-1表达上调。在体内初步证实,Shh可能通过影响eNOS和NO的表达调节血管的收缩舒张功能,通过抑制黏附分子的表达抑制血管炎症,进而发挥抗动脉粥样硬化作用。结论:本研究结果证实,Shh在动脉粥样硬化主动脉组织和内皮细胞损伤中表达下调;Shh的激活可明显抑制内皮细胞氧化应激、炎症因子和线粒体介导的细胞凋亡,Shh与NF-κB存在相互作用,其机制可能是Shh作为一种保护性因子,抑制了NF-κB信号通路所调控的下游内皮细胞损伤和凋亡,进而减轻动脉粥样硬化形成。因此,Shh/NF-κB通路很可能成为防治动脉粥样硬化性相关疾病的通路靶点。