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猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起猪的一种高度接触性传染病,该病严重危害世界养猪业的发展,给养猪业带来巨大的经济损失。本研究就其分离鉴定与血清7型菌株体内诱导基因筛选作了以下工作：1.APP的分离鉴定本研究从四川某猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪中分离到一株革兰氏阴性短杆菌。经染色镜检、生化试验、PCR检测、血清型检测和药敏试验等鉴定,结果表明分离株的生化试验结果与多数APP分离株的一致,采用PCR可扩增出约450bp左右的APP特异性目的条带,利用琼脂扩散试验对分离株进行血清型鉴定为7型,药敏试验结果显示该分离株对大多数药物都比较敏感,仅对林可霉素耐药。综合判定该分离株为猪APP的7型菌株。2.APP7基因组表达文库的构建本研究用pET28a/b/c载体构建表达文库。提取APP血清7型的基因组DNA,经Sau3A I经行不完全酶切,回收0.5～2kb的DNA片段。纯化后的DNA片段与经具有相同酶切位点的BamHI单酶切及CIAP去磷酸化处理的pET28a/b/c质粒连接,将连接产物电转化至DH5a感受态细胞,利用含有卡那抗性的LB平板筛选阳性重组质粒。随机挑选部分阳性克隆进行PCR鉴定和双酶切鉴定,结果显示插入片段在0.5～2kb的范围内,重组阳性率大于85%,共收集阳性克隆约26000个,大于理论计算值,符合文库要求,表明文库构建成功。3.基因组表达文库的筛选采用原位免疫印迹技术对表达文库进行筛选：表达文库转化菌液稀释后均匀涂布于含有kan抗性的LB平板,每个平板含300～500个菌落,37℃培养10h后将菌落影印至灭菌硝酸纤维素膜（NC膜）上。带菌NC膜转移至含kana和IPTG的LB平板37℃诱导培养4h后,用氯仿蒸汽作用15 min以裂解细菌释放蛋白。NC膜用10%脱脂奶粉封闭过夜,并依次与吸附血清和辣根过氧化酶标记的羊抗猪IgG抗体,室温下反应1～2h,用4-氯-1-萘酚显影液进行显色,显色明显高于背景者为初筛阳性克隆,以不含插入片段的pET-28 a/b/c空载体的BL21菌落为阴性对照,按初筛相同步骤进行第二次筛选,最后确定了6个复筛阳性克隆,通过测序和比对,得到Fts A, Fts K和APP71224这3个基因。