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目的:1、建立禽流感病毒小鼠感染模型用以评价奥司他韦对5种HA亚型流感病毒的抑制效果研究;2、构建流感病毒细胞感染模型用以评价中药单体对流感病毒的抑制效果研究;3、季节性H1N1流感病毒NA基因耐药位点分析及几种中药单体化合物在细胞水平对H1N1亚型流感病毒的抑制效果评价和探索抗流感病毒的新方法。方法:1、选用具有代表意义的五种亚型流感病毒分别为:人季节性流感病毒H3N2、H1N1;禽源高致病性流感病毒H5N6、禽源低致病性流感病毒H6N1、H9N2;经跨种感染获得适用性毒株H3N2（禽源小鼠适应株）为评价用病毒,以SPF胚进行病毒扩种。为评价奥司他韦对多种亚型流感病毒的抑制作用,本实验进行小鼠鼻内接种构建小鼠流感病毒感染模型,以奥司他韦为治疗药物通过小鼠灌胃法对预防组,治疗组,病毒组用于观察抑制流感病毒效果,同时以灌服等体积生理盐水为对照组。每日观察临床表现,记录小鼠体重变化及死亡情况。在鼻内接种流感病毒后每3日取各组肺组织,进行病毒肺组织滴度水平测定及通过HE染色进行观察病理变化。2、通过MDCK细胞系进行H1N1亚型流感病毒的扩增培养,获得NA基因全序列进行耐药位点分析。分别以神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和中药单体化合物茶黄素、芦丁、金丝桃苷、羟基红花黄色素A、盐酸药根碱和广藿香醇通过直接作用和间接作用两种方式对H1N1亚型流感病毒抑制作用的评价。结果:1、成功构建了4种亚型流感病毒小鼠感染模型,通过临床表现及病理切片显示:人季节性流感病毒H3N2感染小鼠后无明显临床表现,但可在小鼠肺部复制;人季节性流感病毒H1N1感染小鼠后能够引起小鼠死亡,肺组织病毒滴度高达6.167log10EID50/0.1ml,肺部可见严重炎性变化;H5N6禽流感病毒和H3N2禽流感小鼠适应株感染小鼠后可引起小鼠死亡及高水平肺部病毒滴度;H6N1流感病毒、H9N2流感病毒进行小鼠鼻内接种后不能在肺部进行复制。2、成功构建了人季节性流感病毒H1N1细胞感染模型,并确定以100TCID50接种96孔单层MDCK细胞可使所有接种孔100%具有血凝性。3、通过奥司他韦灌胃治疗发现人季节性流感病毒H3N2、H5N6禽流感病毒和H3N2禽流感小鼠适应株经过奥司他韦的预防及治疗后均可降低肺组织病毒滴度,减轻肺部炎症,或提高小鼠存活率,H1N1流感病毒在奥司他韦的预防和治疗下相关评价指标未获得任何改善,与病毒组相比无差异。4、通过NA编码区全基因序列比较未发现H1N1流感病毒株具有已公布耐药位点及相关位点的突变;通过对多种中药单体化合物进行筛选,获得三种对于抑制具有耐药性流感病毒株有效中药单体化合物。黄素药物浓度为0.125mg/ml以上时可对H1N1流感病毒有抑制作用,芦丁药物浓度为2 mg/ml以上时具有抑制病毒的作用,盐酸药根碱在浓度达1mg/ml时可降低病毒滴度。金丝桃苷、羟基红花黄色素A、广藿香醇暂未体现出具有抗H1N1流感病毒的作用。结论:成功的构建了人季节性流感病毒H3N2、H1N1和禽源H5N6、禽源H3N2小鼠适应株小鼠感染模型。证实禽源H6N1亚型流感病毒、H9N2亚型流感病毒均不能在小鼠肺组织复制。通过预防和治疗方法评价了奥司他韦在多种亚型流感病毒的抑制作用,发现奥司他韦能够有效的抑制人季节性流感病毒H3N2、禽源H5N6流感病毒和禽源H3N2小鼠适应株。同时发现奥司他韦在小鼠感染模型体内和细胞水平上均不能抑制本实验用H1N1亚型人季节性流感病毒。本实验在细胞水平上通过对多种中药单体化合物进行筛选,证实中药单体化合物茶黄素、芦丁、盐酸药根碱对该毒株有较好的抑制作用。由于目前中药单体化合物尚未广泛引用于临床,获得中药单体药量有限无法及时进行小鼠攻毒模型保护试验。