动物乳腺被认为是生产基因工程蛋白药物的最佳场所之一,外源目标基因通过乳腺上皮细胞表达,自然分泌到动物乳汁中,从而获得所需目标蛋白。因此,研究者们在研发如何利用动物乳腺生物反应器生产转基因蛋白药物方面进行了大量探索。其主要步骤包含:(1)构建乳腺特异表达载体,在构建乳腺表达的外源基因时,外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区,即要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列,这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下,使其在乳腺中表达,再通过回收乳汁得到目标蛋白。(2)通过各种转基因方法将乳腺特表达载体导入原核期胚胎或体细胞,获得重组胚胎或转基因细胞;(3)将筛选正确的转基因胚胎或转基因体细胞,通过胚胎移植或核移植技术获得转基因动物个体;(4)将转基因动物个体进一步繁育,筛选检测转基因动物后代乳汁中目标蛋白基因的表达,获得稳定遗传目标基因的转基因动物。然而,现存的技术体系仍存在不可避免的缺陷:(1)需要复杂的技术程序操作,导致转基因结果不稳定。(2)该方法在大动物上转基因成功率极低,造成生产成本居高不下。(3)由于转入的外源目标基因的位置效应,使得目标基因表达水平很低。(4)外源基因在动物体内的异源表达往往给动物健康造成伤害,影响基因工程蛋白药物的生产。目前,国际上很难获得乳腺表达转基因动物。针对上述技术体系缺陷,本研究探索了以腺病毒为载体,直接导入动物乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法。目标基因在动物乳腺上皮细胞中表达,并分泌到乳汁中,从而在动物乳汁中获得重组蛋白药物。其优势在于:(1)不需要构建乳腺特异表达载体,从而简化了转基因蛋白药物生产程序;(2)以腺病毒为载体直接导入乳腺,可获得高表达的目的蛋白药物;(3)乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和转录后加工,蛋白药物产品的生物学活性接近天然产品;(4)目标蛋白药物在乳腺中高水平短期表达,无需对动物进行长期维持培育,可降低生产成本。腺病毒载体以其高效转移并表达目标基因和安全性高诸多优点被应用于基因转移之中。但是,国内外有关腺病毒载体的应用一直侧重于基因治疗方面。目前国际上有关腺病毒基因治疗的临床实例应用已上千种,而国内近3年来也已批准了3个有关腺病毒载体应用于人类基因治疗的基因工程药物。但是,迄今为止,腺病毒载体在重组药物蛋白生产方面至今未见到相关应用报道。为此,本研究以人乳铁蛋白重组腺病毒为载体,进行了乳腺表达生产人乳铁蛋白的试验研究,以期探索出高效、简便的转基因蛋白药物生产方法,从而为转基因蛋白药物生产提供新的途径。本研究共分为五个部分,第一、二部分进行了人乳铁蛋白基因表达载体的构建及人乳铁蛋白cDNA的体外细胞表达,为后面目标基因在动物体内的表达奠定了基础。第三、四部分主要对2种腺病毒载体的构建方法进行了探讨,获得了人乳铁蛋白重组腺病毒高效制备的方法,为进一步利用腺病毒为载体进行乳腺表达奠定了基础。第五部分利用构建成功的重组人乳铁蛋白腺病毒载体,乳腺表达生产人乳铁蛋白蛋白,探讨腺病毒为载体生产转基因蛋白药物的可行性、稳定性及高效性。第一部分人乳铁蛋白cDNA序列的克隆及真核表达载体的构建实验中,首先从人乳腺组织分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人乳铁蛋白的全长cDNA序列,经DNA测序分析,所得hLTF cDNA与GeneBank中一致。并对克隆的人乳铁蛋白基因的编码氨基酸序列进行分析,结果表明,所得人乳铁蛋白基因序列编码的氨基酸与已发表的人乳铁蛋白编码序列完全一致。以pcDNA3.1、pIRES、pDC316为基础质粒,构建了含有人乳铁蛋白基因的重组4种真核表达载体p3LF、pDCLF、pLG和p3LG。其中,真核表达载体p3LF和pDCLF,含有新霉素抗性筛选标记,可进行转染哺乳动物细胞的抗性筛选,真核表达载体pLG和p3LG,内含有GPF报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行实时观测,极大提高了目标蛋白基因检测效率,为后面人乳铁蛋白的表达研究奠定了基础。第二部分人乳铁蛋白cDNA的细胞表达实验中,将上述构建的人乳铁蛋白真核表达载体p3LF、pDCLF、pLG和p3LG分别在COS-7、CHO、和HEK293细胞3种不同细胞株中进行了蛋白表达实验。比较不同真核表达载体在不同哺乳细胞株中的表达效率方法。将其转染进细胞后,CHO和HEK293细胞经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,并克隆化培养,RT-PCR和Western blotting分析显示,培养上清液中分别有较高的hLTF mRNA和蛋白表达,而COS-7细胞未经G418筛选,直接于转染后48h开始检测细胞培养上清,也获得了蛋白表达。体外抑菌实验证实,重组人乳铁蛋白具有较强的抗菌活性。初步建立了体外真核细胞蛋白表达体系,为后面人乳铁蛋白腺病毒载体构建研究奠定了基础。第三部分细菌内高效制备重组人乳铁蛋白腺病毒Ad-hLTF载体的研究,将体外真核表达验证正确的人乳铁蛋白基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-cmv中,酶切鉴定后所得重组质粒pShuttle-hLTF,经PmeI酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5183,所获阳性菌落酶切鉴定正确后,获得的重组人乳铁蛋白腺病毒载体Ad-hLTF,经PacI消化后,将大片段纯化后转染HEK293细胞,包装获得重组人乳铁蛋白腺病毒。PCR鉴定病毒上清含有目标蛋白基因hLTF,Western blotting检测到感染细胞上清中含有人乳铁蛋白的表达。结果表明,利用细菌内同源重组法制备的Ad-hLTF重组腺病毒载体是一种方便、高效的方法,所制备的重组腺病毒在体外能有效表达具有生物活性的hLTF,为后面体内实验研究奠定了基础。第四部分细胞内高效制备重组人乳铁蛋白腺病毒Ad-hLTF载体的研究,为探索利用真核细胞内同源重组生产腺病毒方法,该方法基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶,使转染进293细胞的Shuttle质粒和辅助大质粒发生定点重组,产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺型腺病毒。将目标蛋白基因hLTF克隆至质粒pDC315,该质粒MCS两侧包含有Cre-loxP位点,获得的重组质粒pDC311-hLTF,将其与辅助腺病毒质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得真核细胞内重组包装重组腺病毒Ad-hLTF,PCR鉴定病毒上清含有目标蛋白基因hLTF,Western blotting检测到感染细胞上清中含有人乳铁蛋白的表达,体外抑菌实验结果表明,重组人乳铁蛋白具有较强的抗菌活性。结果表明,利用真核细胞内同源重组法制备的Ad-hLTF重组腺病毒载体是一种更为简便的方法,省去了细菌重组构建大质粒的筛选鉴定过程,所制备的重组腺病毒在体外能有效表达具有生物活性的hLTF。第五部分重组腺病毒Ad-hLTF在兔和羊乳腺中高效表达的研究,将上述构建正确的重组hLTF腺病毒载体,在HEK293细胞中经过4轮扩增,所获病毒经进一步纯化后,最终获得病毒滴度1011-1012PFU/ml。通过将重组hLTF腺病毒在兔和羊的乳腺中的体内表达实验,48 h后分别检测到了兔和羊奶中的hLTF的高表达。结果表明,所构建的重组hLTF腺病毒载体在兔和羊乳腺中均获得了高效表达,Western blotting检测病毒感染后2-10 d的兔和羊的乳汁,可检测到人乳铁蛋白的表达,从Western blotting人乳铁蛋白的特异条带结果分析,兔乳汁中人乳铁蛋白的表达量高于羊乳汁中hLTF的表达量。该体系尚待进一步改进和不断完善。下一步将继续探索腺病毒为载体在羊乳腺中的高效表达。以此,建立腺病毒为载体,乳腺表达生产转基因蛋白药物的技术体系。结论:(1)应用RT-PCR方法直接从人乳腺组织中扩增获得人乳铁蛋白cDNA全序列;(2)构建了4种不同的人乳铁蛋白真核表达载体;(3)获得了人乳铁蛋白cDNA在细胞的体外表达;(4)建立了细菌内同源重组高效制备人乳铁蛋白腺病毒载体的方法,并获得了表达有生物活性的人乳铁蛋白腺病毒载体;(5)建立了细胞内同源重组高效制备人乳铁蛋白腺病毒载体的方法,并获得了表达有生物活性的人乳铁蛋白腺病毒载体;(6)获得了重组人乳铁蛋白腺病毒在兔和羊乳腺中的高效表达。本研究首次以腺病毒为载体,在动物乳腺中,获得了重组人乳铁蛋白的高效表达,为重组人乳铁蛋白的生产奠定了基础。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用,是乳腺生物反应器原理生产转基因蛋白药物产品的新应用。该方法无论在转基因技术理论领域,还是在基因工程药物生产方面,均具有其创造性和实用性。