【摘 要】
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巨大口蘑（Macrocybe gigantea（Massee）Pegler＆Lodge）是热带地区的一种营养丰富的野生珍稀食用菌,目前已驯化栽培成功。巨大口蘑子实体可在8℃～12℃条件下保存30 d不变色,具有极好的抗褐变、耐贮藏特性,研究其抗褐变机理对于食用菌贮藏保鲜有重要意义。随着分子生物技术的发展,功能基因组学研究将是日后的研究重点。遗传转化系统是基因功能研究的重要工具,农杆菌介导的转化法因
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.31272218）； 广东省科技创新战略专项（2018B020206001）； 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设（2019KJ103）；
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巨大口蘑（Macrocybe gigantea（Massee）Pegler＆Lodge）是热带地区的一种营养丰富的野生珍稀食用菌,目前已驯化栽培成功。巨大口蘑子实体可在8℃～12℃条件下保存30 d不变色,具有极好的抗褐变、耐贮藏特性,研究其抗褐变机理对于食用菌贮藏保鲜有重要意义。随着分子生物技术的发展,功能基因组学研究将是日后的研究重点。遗传转化系统是基因功能研究的重要工具,农杆菌介导的转化法因其转化受体材料选择范围广、转化效率高以及操作程序简单等特性,已经成功应用于多种食用菌,但国内外还没有巨大口蘑的遗传转化领域的报道。本研究通过农杆菌介导转化法首次构建了巨大口蘑的遗传转化体系,同时构建了酪氨酸酶基因的过表达载体plasmid4-GT。结果如下:1.采用潮霉素抗性基因Hyg作为筛选标记,通过巨大口蘑的潮霉素敏感性试验,确定了其菌丝体的潮霉素致死浓度为70μg/m L,并将此浓度作为转化子的筛选浓度。通过头孢噻肟霉素对巨大口蘑菌丝和农杆菌的毒性试验,确定了头孢噻肟霉素的抑菌浓度为300μg/m L。2.将双元载体plasmid4转化农杆菌EHA105,以巨大口蘑菌丝为受体材料,Hyg为筛选标记,增强型绿色荧光蛋白基因e GFP为报告基因,建立了巨大口蘑的农杆菌介导转化体系。当共培养温度为25℃,共培养时间为36 h的转化效率最高。3.对随机挑选的拟转化子进行PCR鉴定和绿色荧光表达分析检测,成功扩增出Hyg目标条带并在荧光显微镜下观察到明显绿色荧光,表明Hyg成功整合到巨大口蘑基因组DNA中,e GFP基因在巨大口蘑中得到表达。为验证转化子的有丝分裂稳定性,对转化子传代培养五次,再在荧光显微镜中检测,仍能观测到荧光,表明e GFP基因在巨大口蘑中能够稳定遗传。4.为研究转录组测序筛选的酪氨酸酶基因TYR7523的基因功能,根据其序列设计特异性引物,克隆得到381 bp的目标片段,编码126个氨基酸。预测的氨基酸序列中Cu B结构域高度保守,结合3个组氨酸残基,形成HCu Bxxx HCu Bx（n）Fxx HHCu B结构,但是缺乏Cu A结构域;另外含有“tyrosine motif”,即Y/Fx Y motif,其对N端结构域的整体结构完整性十分重要。5.根据巨大口蘑基因组数据gpd编码序列起始密码子ATG上游1000 bp左右序列设计特异性引物,克隆得到1019 bp的gpd启动子序列,构建了TYR7523的过表达载体plasmid4-GT。
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