论文部分内容阅读
植物受到重金属镉胁迫后,会造成ROS大量爆发,从而对植物生长产生氧化损伤。在拟南芥中,研究发现根尖中两种ROS成分(过氧化氢,H2O2和超氧阴离子O2·-)对植物根的生长和分化具有重要作用,其二者在正常根系中维持一种平衡状态,而这种平衡被打破则抑制植物根的生长。同时亦有研究证明H2S可以清除镉污染下植物体内ROS积累。因此本研究据此上两种理论,推测镉污染对于抑制不结球白菜根系生长是否与根尖中ROS平衡状态被破坏有关,以及在镉污染下内源H2S是否也参与调节了活性氧平衡通路。本研究利用荧光组织染色技术和荧光定量方法研究镉污染与ROS平衡之间的关系对根生长的影响以及气体信号分子H2S在此过程中所起的作用。主要研究结果如下:1、镉在4 μM和16 μM浓度下处理不结球白菜根尖72 h,均抑制根的生长,抑制率分别是23%和53%,但是组织化学染色证实4μM镉没有引起根尖氧化损伤和细胞死亡,而16 μM镉则引起了此反应;4 μμM镉处理不同时间与对照相比提高了根尖H2O2含量、降低O2·-含量下降;16μM镉处理则同时通过了根尖H2O2、O2·-含量;通过外源添加NADPH氧化酶抑制剂二联苯碘清除根尖O2·-和外源添加H2O2均抑制根生长,即O2广正向调控根生长、H2O2负向调控根生长。结果表明4 μM镉处理对不结球白菜根生长的抑制作用是由于破坏了根尖ROS平衡,且没有引起根尖的氧化损伤。2、4 μM镉处理不同时间后提高了根尖中内源H2S含量,并诱导编码H2S产生Br_LCDs和BrDCDs基因表达上调;在4 μM Cd处理的基础上通过外源添加H2S合成酶抑制剂D-炔炳基氨基酸和清除剂亚硫磺酸,降低了根尖中内源H2S的含量,根尖中H2O2含量下降、O2·-含量上升,此结果与单独4μM镉处理呈现相反的趋势,且此显著缓解了单独4 μM镉对根生长抑制效应。结果说明根尖中内源H2S参与调节了镉胁迫下根尖活性氧平衡状态进而影响根的生长。3、在拟南芥根长试验中,UPB1作为一个转录因子能够通过抑制几个POD靶基因的表达,进一步控制根尖中O2·-和H2O2的平衡来影响根的生长。在不结球白菜数据库进行BLAST比对获得2个Br_UPB1s基因(Bra00446B,Br_UPB1A;Bra021395,Br_UPB1B)和 4 个POD 基因(Bra035235、Bra033551、Bra006423、Bra023639);4 μM镉处理导致Br_UPB1A和Br_UPB1B表达上调,以及UPB1下游靶基因表达下调,在4 μM镉胁迫的基础上外源添加H2S合成酶抑制剂D-炔炳基氨基酸和清除剂亚硫磺酸则能够逆转单独4μ 镉处理下Br_UPB14、Br_UPB1B和部分下游靶基因的表达。说明H2S是通过参与调控Br_UPB1及其靶基因的表达,参与调节根尖ROS平衡来影响根的生长。4、选取试验中基因表达效果更明显Br_UPB1A基因进行克隆和生物信息学分析,Br_UPB1A基因总长为309 bp,编码102个氨基酸,无内含子分布,具有由56个氨基酸组成的典型转录因子basic helix-loop-helix(bHLH)保守结构域,又由于其保守域中缺乏谷氨酸(Glu,E-13)和精氨酸(Arg,R-16)而分属于非典型bHLH转录因子,即non-DNA-结合蛋白,此类转录因子主要是与其它bHLH的转录因子形成二聚体来行使功能,然而通过数据库检索未能发现关于Br_UPB1A及其同源蛋白AtUPB1的互作蛋白。Br_UPB1A蛋白质属于亲水蛋白,其二级结构主要由α-螺旋(helix)和无规则卷曲(coil)组成,遍布于整个Br_UPB1A蛋白质结构中。