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目的:流感病毒是一类具有高度传染性的呼吸道病毒,每年全球有25-50万人因感染流感病毒致病或死亡。老龄人群由于免疫衰老对包括流感病毒在内的传染性疾病的发病率和死亡率均高于成年人。预防流感最有效的方法为疫苗接种,但研究表明传统流感疫苗在老龄人口中的有效性只有不足50%,而在成年人中有效性可达90%。随着世界人口老龄化日益严重,研发针对老龄人群安全有效的新型流感疫苗意义重大。为此,我们分别用整合免疫佐剂和改变免疫途径两种方法,探讨流感病毒VLPs在老龄小鼠中的免疫原性,希望为研发针对老龄人群的高效新型流感疫苗提供实验室依据,从而启示其他老年性疾病疫苗的开发和应用。方法:整合了免疫佐剂的新型流感病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗,通过不同免疫途径,探讨以H1N1流感病毒A/Perto Rico/8/34(PR8)为基础的VLPs在老龄小鼠中的免疫原性。(1)利用昆虫重组杆状病毒(Recombinant baculovirus,rBVs)表达系统,将整合有免疫佐剂-细菌鞭毛蛋白flagellin的PR8流感病毒血凝素蛋白HA及野生型流感病毒HA分别与神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)和基质蛋白(Matrix proteins,M1)共表达,在体外组装成新型流感病毒样颗粒,分别命名为Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs。用电镜观察VLPs的形态,Western Blot方法检测flagellin、HA和M1的含量,血凝实验检测HA活性,定量ELISA方法计算每微克VLPs中的HA实际含量,并用制备的VLPs刺激骨髓来源的树突状细胞,采用Cytokine ELISA方法测定VLPs体外生物学活性。(2) HA含量和活性相同的Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs分别通过肌肉注射免疫老龄小鼠和成年小鼠,初次免疫四周后加强免疫一次。每次免疫两周后采用眶后静脉丛刺破法采血,用ELISA方法鉴定血清中抗HA特异性抗体的产生,血凝抑制实验计算抗体滴度。加强免疫四周后,用致死量的同源鼠适应流感病毒A/PR/8/34,或者异源鼠适应流感病毒A/California/04/2009进行攻毒。攻毒后每天固定时间对小鼠称重并观察发病情况,攻毒后15天对小鼠采取安乐处死,取脾脏淋巴细胞,进行ELISPOT检测特异性细胞因子的产生。(3)2μg PR8 VLPs分别通过肌肉注射(IM)和皮内注射(ID)两种途径免疫老龄小鼠和成年小鼠,免疫过程如前,用ELISA方法鉴定血清中抗HA特异性抗体的产生,血凝抑制实验计算抗体滴度。加强免疫四周后,用致死量的同源鼠适应流感病毒A/PR/8/34,或者异源鼠适应流感病毒A/California/04/2009进行攻毒。攻毒后每天固定时间对小鼠称重并观察发病情况,攻毒后15天对小鼠采取安乐处死,取脾脏淋巴细胞,ELISPOT检测特异性细胞因子的产生。结果:(1)VLPs特性检测结果:经纯化的Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs均保持了与流感病毒粒子相似的形态及大小,说明整合flagellin并不影响VLPs的正常结构。Western Blot与血凝实验结果表明,Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs中HA含量相同且具有正常的生物学活性;定量ELISA显示,每微克Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs均含有约6.8纳克HA蛋白;Cytokine ELISA表明,无论在成年小鼠还是老龄小鼠中Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs均能刺激树突状细胞产生细胞因子TNF-α,但是Flic-PR8 VLPs刺激TNF-α产生的能力更强,并且增加Flic-PR8 VLPs刺激浓度对TNF-α产生影响不大,充分说明了flagellin作为免疫佐剂在其中发挥了重要免疫增强作用。(2)VLPs免疫小鼠体内免疫应答反应检测结果:分别用Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs经肌肉注射途径免疫小鼠,成年小鼠组体内产生的血清特异性抗体水平显著高于老龄小鼠组。然而在老龄小鼠组内,经加强免疫后Flic-PR8 VLPs与PR8 VLPs相比,前者能诱导更高水平的IgG,且以IgG2a亚型为主。血凝抑制实验结果显示,血清HI滴度在Flic-PR8 VLPs免疫的老龄小鼠组达到了214,而PR8 VLPs免疫的老龄小鼠组其滴度只有128,前者为后者的1.7倍,该结果与ELISA结果相符,说明Flic-PR8 VLPs能诱导更高效的抗HA抗体。(3)病毒攻击实验结果:用致死剂量同源鼠适应A/PR/8/34流感病毒攻击时,虽然PR8 VLPs和Flic-PR8 VLPs均能够对被免疫老龄小鼠提供一定的保护作用,但对老龄小鼠的保护效果明显劣于成年小鼠组,体现在老龄小鼠体重下降程度较大,然而用致死剂量异源鼠适应A/California/04/2009流感病毒攻击时,只有Flic-PR8 VLPs能够对被免疫小鼠提供保护作用,而PR8 VLPs免疫的小鼠全部死亡,充分说明Flic-PR8 VLPs具有更好的免疫原性。(4)不同免疫途径免疫应答反应结果:PR8 VLPs经IM和ID途径分别免疫小鼠后,IM组中成年小鼠组HA特异性IgG抗体水平略高于ID组,与之相反的是,在老龄小鼠组,虽然经IM与ID免疫所产生的抗体水平均较成年小鼠组低15倍之多,但是ID组产生的IgG抗体水平约为IM组的1.5倍。进一步应用ELISA方法对IgG亚型抗体分析表明,在老龄小鼠中,经ID途径免疫能够诱发更高水平的抗原特异性IgG1产生,说明ID途径免疫能够通过Th2型免疫反应提高流感病毒VLPs在老龄小鼠中的免疫原性。与ELISA结果相符,经ID免疫的老龄小鼠组HI滴度达到了288,而IM免疫的老龄小鼠组HI滴度只有100,前者为后者的2.8倍左右,表明ID途径免疫能诱导高效价的抗HA抗体产生。(5)不同免疫途径条件下病毒攻击实验结果:ID途径免疫可提高对老龄小鼠免疫原性,主要表现在用致死剂量同源鼠适应A/PR/8/34流感病毒攻击时,IM与ID均能够对被免疫老龄小鼠提供一定程度保护作用,但对老龄小鼠的保护效果明显劣于成年小鼠组,表现在老年小鼠体重下降程度较大。但是用致死剂量异源鼠适应性A/California/04/2009流感病毒攻击,只有ID途径免疫PR8 VLPs能够对被免疫老龄小鼠提供保护,而IM途径免疫PR8 VLPs I的老龄小鼠全部死亡。结论:(1)成功制备了整合免疫佐剂的流感病毒Flic-PR8 VLPs和野生型流感病毒PR8 VLPs,两种流感病毒样颗粒的HA含量相同。(2)Flic-PR8 VLPs和PR8 VLPs肌肉注射免疫成年和老龄小鼠,Flic-PR8 VLPs显示较强的免疫原性。(3)肌肉注射和皮内注射两种途径免疫成年和老龄小鼠,成年小鼠组中两种免疫途径免疫原性未见显著差异,老龄小鼠组中皮内注射免疫途径的免疫原性明显高于肌肉注射免疫途径。(4)可以通过添加免疫佐剂和改变免疫途径两种方法入手,研发出针对老龄人群更为安全有效的新型流感疫苗。实验结果为深入探讨并开发针对免疫衰老的老龄人群的新型疫苗奠定了理论及实验基础。