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目的青光眼是全球第2位不可逆致盲眼病，其病理基础为视网膜节细胞轴突损伤后发生细胞凋亡。针对视网膜节细胞轴突损害进行的神经再生治疗是青光眼防治的根本措施。最新的研究结果提示，星形胶质细胞活化可能是抑制哺乳动物中枢神经系统再生最重要的因素。本研究分别通过基因敲除星形胶质特异性中间丝成分GFAP和Vimentin以减弱其活化能力或者通过GFAP-TK和GCV系统选择性杀死活化星形胶质细胞来探索活化星形胶质细胞去抑制对视神经再生的调控作用。
方法1.转基因和基因敲除实验动物Bcl-2高表达转基因小鼠(Bcl-2tg)、GFAP-TK转基因小鼠(GFAP-TKtg)、GFAP/Vimentin双基因敲除小鼠(GFAP-/-/Vim-/-)、Bcl-2转基因+GFAP-/-/Vim-/-双基因敲除三基因突变小鼠(Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-)、Bcl-2和GFAP-TK双转基因小鼠(Bcl-2tg/GFAP-TKtg)。对照组实验动物采用上述各种实验小鼠同窝的相应非转基因小鼠。
2.大脑皮质星形胶质细胞分离、原代培养以及诱导激活分别从出生当天(P0)或出生后一天(P1)野生型C57BL/6J小鼠和GFAP/Vimentin双基因敲除小鼠大脑皮质分离培养星形胶质细胞。星形胶质细胞原代培养4周后，使用曼陀罗凝集素(DSA)刺激未成熟星形胶质细胞进行分化和激活。观察并比较两组星形胶质细胞的形态以及DSA激活后的反应。
3.视网膜-上丘组织器官共培养分别选取出生后3天(P3)Bcl-2高表达转基因小鼠和野生型C57BL/6J小鼠的视网膜并分别与出生后5天(P5)的C57BL/6J和GFAP-/-/Vim-/-小鼠上丘(superiorcolliculus)组织切片并置共培养5天，应用红色DiI细小结晶颗粒显示从视网膜长入上丘的轴突纤维。
4.视神经完全性钳断手术分别在P5和P20Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠及其同窝GFAP-/-/Vim-/-对照小鼠进行标准的右眼视神经完全性钳断手术；在成年Bcl-2tg/GFAP-TKtg双转基因小鼠及其同窝的GFAP-TKtg，Bcl-2tg和野生型小鼠中行视神经完全性钳断手术。在部分实验动物中，术中同时在玻璃体腔内注射霍乱毒素B亚单位结合的荧光素标记物CTB-FITC或CTB-Rhodamine，或者增强表达绿色荧光蛋白的复制缺陷型腺相关病毒(AAV-EGFP)用于顺行性标记再生轴突是否达到上位视觉中枢外侧膝状体及上丘。所有手术在单侧右眼完成。
5.视神经损伤后GFAP表达的WesternBlot和RT-PCR检测分别选取8-12周龄成年野生型C57BL/6J小鼠未进行视神经钳断手术的视神经4根及行视神经钳断手术后三天的视神经4根分别提取细胞总蛋白质和总RNA进行GFAP的WesternBlot和RT-PCR检测。
6.组织切片制作及免疫荧光染色4％多聚甲醛心脏灌注后获取完整眼球、视神经和大脑标本，OCT包埋制作冰冻切片。眼球及视神经标本以平行视神经轴向作冷冻切片，厚度10μm。脑组织作冠状连续切片，厚度20μm。在相邻的眼球及视神经切片上分别加兔抗GAP-43多克隆抗体(1：400)和鼠抗GFAP单克隆抗体(1：200)，抗体溶于3％胎牛血清白蛋白+0.3％Triton100中。二抗使用Cy3或Cy5标记的抗兔或抗鼠单Ⅱ克隆抗体。NikonTE300荧光显微镜和Leica共焦显微镜下观察，计数定量以及照相。
7.电生理检查和视觉功能检查对部分P20Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在视神经手术后10天，获取包括背外侧膝状体核的旁矢状大脑组织切片，并进行全细胞膜片钳检查以确定视神经再生轴突是否达到背外侧膝状体核，并与其神经元建立了突触联系。视神经手术前、手术后1天及手术后10天分别进行瞳孔对光反射检查。
结果1.大脑皮质星形胶质细胞分离培养及DSA激活实验发现培养的野生型C57BL/6J星形胶质细胞经DSA激活后，细胞肥大增生，突起明显延长并超过细胞体尺寸，同时GFAP免疫荧光染色呈较强阳性。GFAP-/-/Vim-/-双基因敲除小鼠的星形胶质细胞形态钝圆，细胞突起短小，对DSA反应不明显。
2.视网膜-上丘组织器官共培养P3野生型C57BL/6J小鼠的视网膜与P5C57BL/6J小鼠上丘组织切片共培养没有发现明显的再生轴突从视网膜长入上丘；而在P3Bcl-2高表达转基因小鼠视网膜与P5C57BL/6J小鼠上丘组织切片共培养后，可见稀疏的再生轴突长入上丘组织；P3野生型C57BL/6J小鼠的视网膜与P5GFAP-/-/Vim-/-小鼠上丘组织切片共培养后也可以看到少量再生轴突从视网膜长入上丘；在P3Bcl-2高表达转基因小鼠视网膜与P5GFAP-/-/Vim-/-小鼠上丘组织切片共培养后出现强烈的轴突再生，可以发现大量的再生轴突从视网膜长入上丘。
3.视神经损伤后GFAP表达增强在8-12周龄成年野生型C57BL/6J小鼠中，对未进行视神经钳断手术的视神经4根及行视神经钳断手术后三天的视神经4根分别提取细胞总蛋白质和总RNA进行GFAP的WesternBlot和RT-PCR检测后发现，视神经损伤后GFAP表达明显增强。
Ⅲ4.Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠活体内轴突再生情况P5Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在视神经手术后5天经GAP43免疫荧光染色和CTB标记可见完全性视神经再生，并且再生轴突纤维延伸达到视神经手术同侧(右侧)的上位视觉中枢。P20Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在视神经手术后10天多数标本没有再生或仅可见短小的塌陷中的出芽轴突(N=6)，在部分标本仅可见微弱的轴突再生(N=1)，再生纤维位于视神经周边壳膜与胶质瘢痕之间的空隙，延伸范围小于500μm。P20Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在视神经手术后10天全细胞膜片钳电生理检查呈阴性反应，视神经手术后1天及10天瞳孔对光反射也呈阴性。
5.成年Bcl-2tg/GFAP-TKtg双转基因和GFAP-TKtg转基因小鼠活体内轴突再生情况在Bcl-2tg/GFAP-TKtg双转基因小鼠中存在明显的视神经轴突再生。术后5天时再生的轴突纤维已开始出现，散在分布于视神经鞘膜下，其延伸长度可达钳夹部位远端200μm。手术后10天再生纤维最长延续到钳夹部位远端3-4mm，推算其再生速度达到300-400μm/天，但是再生轴突均未能达到上位视觉中枢；在GFAP-TK单转基因小鼠中也可以发现在视神经周边部位有很少数纤维出现间断性的出芽(sprouting)再生，但是这些纤维最远仅达到钳夹部位远端约250μm附近，多数局限于50-100μm以内，并且已经发生不同程度的降解。术后10天Bcl-2tg/GFAP-TKtg组再生轴突数目为69.70±18.04(N=6)，GFAP-TK转基因组再生轴突数目为17.06±7.92(N=6)，前者显著多于后者(P＜0.001)。GFAP免疫荧光提示Bcl-2tg/GFAP-TKtg和GFAP-TKtg小鼠中视神经钳断部位激活的星形胶质细胞被清除。
结论1.在Bcl-2转基因和GFAP/Vimentin基因敲除小鼠中，出生后5天行视神经钳断手术后可以获得完全性“形态性”视神经再生，但是多数再生纤维达到损伤同侧的上位视觉中枢。
2.出生后20天时，Bcl-2转基因和GFAP/Vimentin基因敲除不再具有显著促进Ⅳ视神经轴突再生的作用。
3.在成年小鼠，Bcl-2转基因和GFAP-TK/GCV系统可以获得一定程度“形态性”视神经轴突再生，而再生轴突不能达到上位视觉中枢。
4.活化星形胶质细胞是抑制视神经再生的重要因素。通过活化星形胶质细胞去抑制可以促进视神经再生。
5.抑制哺乳动物中枢神经系统再生的微环境可能由多种因素构成，活化星形胶质细胞只是其中之一。