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硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有多糖与硒二者的活性,且其生物活性普遍高于多糖和硒,更易于为机体吸收和利用。硒多糖具有调节免疫、抗氧化、抗金属中毒、抗癌、和拮抗重金属等。临床上主要以多糖复方防治动物疾病。本研究首先提取制备了三种中药多糖及其硒化多糖,将其和本实验室前期通过系列试验筛选出的七种抗氧化活性较强的中药多糖以1:9的比例组成18个多糖-硒化多糖复方,通过清除自由基试验初步筛选出3个作用较强的复方,进一步通过复方对鸡胚肝细胞抗氧化损伤能力试验和体内试验比较3个复方的抗氧化活性,筛选出抗氧化活性最强的复方CAP-sLBP。本研究的目的,旨在验证多糖-硒化多糖复方的抗氧化作用,筛选出活性最强的复方,为研制抗氧化中药多糖制剂提供理论依据。试验分为以下四个部分:试验Ⅰ 多糖的提取纯化和硒化修饰 首先用水煎醇沉法提取枸杞、白术、当归粗多糖,用三氯乙酸法去蛋白,过DEAE-52纤维素柱,冷冻干燥,得到纯化的枸杞多糖(LBP)、白术多糖(AMP)、当归多糖(CAP)。采用本研究室以前优化的修饰条件用硝酸-亚硒酸钠(NA-SS)法进行硒化修饰,得到硒化枸杞多糖(sLBP)、硒化白术多糖(sAMP)、硒化当归多糖(sCAP)。测定产物的得率以及糖含量,结果显示,三种粗多糖的得率在8.26%～15.23%,三种硒化多糖的得率在29.13%～39.87%,三种多糖及其硒化多糖的糖含量在28.35%～61.30%。试验Ⅱ 多糖-硒化多糖复方体外清除自由基能力的比较 以前期研究筛选出的抗氧化活性较强的枸杞多糖(LBP)、白术多糖(AMP)、当归多糖(CAP)、党参多糖(CPP)、大蒜多糖(GP)、百合多糖(LP)、五味子多糖(SCP)和硒化枸杞多糖(sLBP)、硒化白术多糖(sAMP)、硒化当归多糖(sCAP)为组分药,以糖含量按照多糖-硒化多糖9:1的比例组成18个复方,然后用蒸馏水倍比稀释成5个浓度,测定它们对DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的清除能力。结果表明,多糖-硒化多糖复方对3种自由基均有不同程度的清除能力,且清除率与剂量呈正相关;对DPPH自由基的平均清除率排在前3位的是LBP-sAMP、CAP-sLBP、LBP-sCAP;对羟自由基的平均清除率排在前3位的是LBP-sAMP、CAP-sAMP、SCP-sLBP;对ABTS自由基的平均清除率排在前3位的是 LBP-sAMP、CAP-sLBP、LBP-sCAP。综合比较,LBP-sAMP、CAP-sLBP和CAP-sAMP的抗氧化活性较强。试验Ⅲ 多糖-硒化多糖复方对鸡胚肝细胞抗氧化损伤能力的影响 比较了前面筛选出的3个抗氧化活性较强的多糖-硒化多糖复方(CAP-sLBP、LBP-sAMP和CAP-sAMP)对鸡胚肝细胞(CEL)抗氧化损伤能力的影响。首先用MTT法测定了 3个复方和对照药VC对CEL的安全浓度,然后取安全浓度范围内3种浓度的各药加入到CEL的培养体系中,培养24 h后加入H2O2攻击1 h,用MTT法测定CEL活力(A570值)、用试剂盒测定CEL内ROS含量、GSH-Px和SOD活性的变化。结果显示,H2O2组的细胞A570值最小、ROS含量最高、GSH-Px和SOD活性最低,与细胞对照组的差异显著;3个复方和VC组的A570值均大于或显著大于H2O2组、ROS含量均低于或显著低于H2O2组、GSH-Px和SOD活性均高于或显著高于H2O2组,高浓度的作用显著;CAP-sLBP 3个浓度的作用均强于相同浓度的LBP-sAMP和CAP-sAMP。结果表明,3个复方均具有较强的抗氧化活性,能够抵抗H2O2引起的鸡胚肝细胞活力降低、细胞内ROS含量升高和抗氧化酶活性降低,从而鸡胚肝细胞抗氧化损伤的能力,CAP-sLBP复方的作用最强。试验Ⅳ 多糖-硒化多糖复方对鸡抗氧化能力的影响 比较了前面筛选出的3个多糖-硒化多糖复方(CAP-sLBP、LBP-sAMP和CAP-sAMP)对鸡抗氧化功能的影响。14日龄雏鸡270羽随机分为9组,每组30羽,除空白对照组(BC)外均用新城疫Ⅳ系苗点眼滴鼻免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,6个多糖组每只鸡分别肌肉注射两种浓度的3个多糖-硒化多糖复方0.5 ml,免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)注射生理盐水0.5 mL,每天1次,连续3天。分别于一免后第7、14、21、28 d翼静脉采血,分离血清,测定CAT、SOD、GSH-Px和MDA的含量。结果显示,6个复方组在4个时间点的血清CAT、SOD、GSH-Px活性多高于或显著高于对照组,MDA含量均低于、多显著低于对照组;CAP-sLBP组的3种抗氧化酶活性均为最高、MDA含量最低。结果表明,3个复方均有不同程度的抗氧化活性,能够提高鸡的抗氧化功能,CAP-sLBP的抗氧化活性最强。