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心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,MI/R）严重影响冠脉搭桥、冠脉腔内成形或溶栓、心脏移植、心内直视手术等冠脉血流再通后患者的预后,已成为影响心血管外科手术疗效的一大难题。早期诊断与及时干预对提高患者心功能恢复及生活质量具有重要价值,但目前临床缺少特异性MI/R诊断方法。靶向超声造影成像具有敏感性高、操作方便、可实时定量分析等优点,是实时无创评估MI/R的理想成像方式。但传统靶向超声微泡存在易脱靶、免疫原性、工艺复杂等缺点。大量研究表明,MI/R早期血小板大量聚集于损伤心肌区,这提示我们可提取血小板膜制备新型血小板膜微泡,通过模拟血小板的天然靶向性评价心肌缺血再灌注损伤。基于此,我们制备了一种血小板膜包裹的仿生微泡（Platelet membrane microparticles,PMPs）,该微泡内核为填充全氟丙烷气体的中空球体聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）高分子微泡,可产生超声造影信号,外壳包裹血小板膜作为天然靶向材料,使造影剂靶向聚集于MI/R部位,通过体内外实验评价PMPs的靶向性及PMPs超声造影在MI/R中的诊断价值。本研究包括以下三个方面:第一部分仿生微泡的制备与性质评价目的制备PMPs及其红细胞膜包裹的对照微泡（RBC membrane microparticles,RMPs）,并对其微泡表征进行评价。方法采用双乳化溶剂蒸发法制备PLGA微泡造影剂,经冷冻干燥后获得表面有孔的中空PLGA微球,抽真空后将微球内部气体置换为全氟丙烷（C3F8）,即为PLGA微泡（PLGA microparticles,PMs）。采用差速离心法和反复冻融法提取大鼠血小板膜,采用低渗处理提取大鼠红细胞膜,将PMs与血小板膜或红细胞膜按一定比例混合,超声波处理3分钟,离心后可获得PMPs或RMPs,体外评估其形态、粒径大小、粒径分布、电位、粒径稳定性及造影效果,使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）判断PMPs表面蛋白组成和血小板膜表面蛋白的相似性,并用透射电镜以及荧光显微镜验证包膜是否成功。结果（1）双乳化溶剂蒸发法制备的PMs经冷冻干燥后呈蓬松的白色粉末,在水中分散性好,粒径分布均一,平均水合粒径为2.11±0.49μm,表面电位为-38.51±0.13 m V;经超声处理包膜之后的PMPs的平均水合粒径为2.25±0.34μm,表面电位为-28.35±0.22 m V;RMPs的平均水合粒径为2.31±0.20μm,表面电位为-28.56±0.24 m V。结果表明三者粒径大小相似,稳定性好,包膜过程并未影响微泡粒径,包膜后的粒子电位有所升高,更接近血小板膜和红细胞膜的电位,提示包膜成功。（2）透射电镜以及荧光显微镜结果显示血小板膜和红细胞膜成功地包裹在PMs表面。（3）SDS-PAGE结果显示PMPs或RMPs的蛋白组成和血小板膜或红细胞膜一致,表明提膜以及包膜过程没有损失细胞膜表面的主要蛋白组成,且膜成功转移到PMPs、RMPs表面,进一步提示成功包膜。（4）在体外,PMs、PMPs以及RMPs均具有良好的超声造影效果。结论本研究成功制备了PMs,PMPs和RMPs,粒径均一,在体外具有良好的稳定性和超声造影效果。第二部分仿生微泡体外粘附效果评价目的以肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激后的脐静脉内皮细胞（HUVECs）以及IV型胶原蛋白,模拟MI/R发生时血管内皮体外损伤模型,验证PMPs靶向粘附效果。方法应用TNF-α刺激HUVECs 24h后使细胞处于炎症状态,对照组为未刺激的HUVECs,分别与PMs、PMPs和RMPs孵育后在荧光显微镜下观察微泡与细胞的粘附情况,并用Image J软件进行荧光值定量分析;同样,将IV型胶原蛋白在24孔板铺板后分别与PMs、PMPs和RMPs孵育,并在荧光显微镜下观察并计数每高倍镜视野的微泡数量并分析。结果（1）镜下PMPs与TNF-α刺激的HUVECs孵育后可见大量粘附,而与正常未刺激的HUVECs粘附较少;PMs和RMPs与两类HUVECs均几乎没有粘附。荧光定量分析示TNF-α刺激后的HUVECs与PMPs孵育组荧光强度明显高于其他对照组,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（2）与IV型胶原蛋白平铺的24孔板孵育后,可见PMPs与IV型胶原蛋白大量粘附,PMs和RMPs几乎没有粘附,高倍镜下计数分析差异具有显著性（P＜0.01）。结论PMPs能够与TNF-α刺激后的HUVECs和IV型胶原蛋白特异性结合,推测对受损的血管内皮具有较好的靶向性,可作为靶向超声造影剂评估MI/R损伤。第三部分仿生微泡超声造影评价大鼠心肌缺血再灌注损伤目的研究血小板仿生靶向微泡超声造影成像评价大鼠MI/R损伤的效果。方法制备大鼠MI/R模型,以只开胸穿线但不结扎大鼠作为假手术对照组,结扎左前降支后再灌注之前使用声诺维心肌灌注成像定位缺血危险区域以及远端正常心肌区域。再灌注后立即行PMPs和RMPs靶向超声造影成像,按照前述实验定位的区域勾画感兴趣区（危险区域和远端正常心肌区域）并用Q-lab软件进行超声信号定量分析;注射DiR标记的PMPs和RMPs后取心,离体器官荧光成像评估PMPs心脏组织中的靶向富集现象;注射DiI标记的PMPs和RMPs后取心,免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下观察PMPs在心脏组织中的分布。结果（1）共对32只大鼠进行了靶向超声造影成像,（MI/R组=16;假手术组=16）。（2）左前降支结扎后再灌注之前,声诺维灌注成像可见左室前壁充盈缺损,为缺血区域（危险区域）,TIC曲线定量分析提示结扎后危险区域超声信号极低,而远端正常心肌区域（左室后壁）超声信号正常,提示结扎成功造成了缺血现象。（3）注射PMPs行超声造影成像,210 s平台期TIC分析显示MI/R组大鼠的左室前壁危险区域信号强度明显高于左室后壁的远端正常心肌区域,二者有显著性差异（危险区域:19.07±1.8 d B;远端正常心肌区域:4.83±0.51 d B;P＜0.01）;而假手术组左室前壁危险区域信号强度与左室后壁的远端正常心肌区域无显著性差异（危险区域:3.57±0.87 d B;远端正常心肌区域:3.14±0.82 d B;P＞0.05）。注射RMPs行超声造影成像,MI/R组和假手术组的左室前壁危险区域与左室后壁的超声信号强度均无显著性差异（P＞0.05）。（4）免疫荧光染色分析结果显示,注射DiI标记的PMPs后,MI/R大鼠的左室前壁危险区域范围心肌间质中可见大量红色荧光显示,而左室后壁的远端正常心肌区域心肌间质中仅见少量红色荧光显示;假手术组的的左室前壁危险区域范围和左室后壁的远端正常心肌区域心肌间质中无明显红色荧光显示。（5）离体心脏荧光成像结果显示,注射DiI标记的PMPs后,MI/R大鼠心肌有明显红色荧光,荧光定量分析提示心脏荧光强度比RMPs高3.9倍,比假手术组的PMPs或RMPs分别高4.8倍和8.7倍,差异均具有显著性（P＞0.05）。注射RMPs的MI/R大鼠和假手术大鼠荧光强度均很弱且没有显著性差异（P＞0.05）。结论PMPs可向体内MI/R发生区域靶向聚集,超声造影成像后信号分析可见MI/R区信号显著增强。血小板膜仿生微粒超声造影有望为MI/R早期诊断提供一种新的检测方法。