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合体滋养细胞作为母胎屏障的重要组成部分,承担母胎间营养、气体交换和激素分泌等生物学功能,在维持正常妊娠的过程中扮演重要角色。Notch信号在人干细胞生态位的自我更新和分化,决定细胞命运发挥重要作用。Notch3作为Notch信号通路受体蛋白,亦可决定人胎盘滋养细胞命运,但其在人胎盘合体滋养细胞分化中的作用,以及此生物过程调控异常是否参与子痫前期的发生,目前均不明确。本研究利用人早孕绒毛、足月胎盘组织、原代滋养细胞(Primary Human Trophoblast,PHT)及BeWo细胞合体化模型,采用IFC、IHC、Western blot及qRT-PCR等检测技术,验证Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式,明确Notch3在滋养细胞合体化过程中的作用;采用血清饥饿法阻滞BeWo细胞周期验证细胞周期阻滞对滋养细胞合体化过程的影响;利用缺氧培养BeWo细胞模型验证缺氧对滋养细胞合体化过程的影响;最后利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,明确Notch3对孕鼠的影响以及探究Notch3在子痫前期发病中的作用。现研究结果如下:一、Notch3在人胎盘滋养细胞中的表达模式利用人原代滋养细胞体外自发合体化模型、人足月胎盘组织、人早孕绒毛组织及绒毛合体滋养细胞重建组织,采用qRT-PCR、IHC及IFC等检测技术,检测Notch3在人滋养细胞中的表达模式。结果显示:在人原代滋养细胞体外自发合体化模型中,Notch3及其它Notch家族受体及配体mRNA水平均发生下调;Notch3在人早孕绒毛及足月胎盘组织中主要表达于单核的细胞滋养细胞中,在合体滋养细胞中呈低表达;在人早孕绒毛新生合体滋养细胞中,Notch3的表达亦较低。二、Notch3在BeWo细胞合体化过程中的作用利用福斯克林(Forskolin,FSK)体外诱导BeWo细胞合体化,并使用Notch3信号通路抑制剂DAPT直接抑制Notch3胞内结构域(Notch3Intracellular Domain,N3ICD)入核,采用IFC、qRT-PCR及Western blot等检测技术,探究Notch3对BeWo细胞合体化的影响。结果显示:Notch3在BeWo细胞合体化过程中表达下调,并主要表达于单个核的BeWo细胞中,在合体BeWo细胞中表达较低;DAPT处理BeWo细胞后,细胞核内N3ICD水平降低,抑制Notch3信号激活,BeWo细胞合体化能力增强。三、细胞周期阻滞对BeWo细胞合体化过程的影响采用无血清饥饿法培养BeWo细胞诱导细胞周期同步化模型,以阻滞BeWo细胞周期于G1期。利用IFC、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等检测技术,明确BeWo细胞周期阻滞对其合体化过程的影响。结果显示:BeWo细胞经无血清饥饿法培养24 h后,G1期BeWo细胞数量增多,细胞周期成功阻滞于G1期;BeWo细胞周期阻滞后,促进了BeWo细胞合体化进程。四、缺氧对BeWo细胞合体化过程的影响采用缺氧培养BeWo细胞,利用qRT-PCR、Western blot、IFC及ELISA等检测技术探究缺氧经Notch3信号通路对BeWo细胞合体化过程的影响。结果显示:在缺氧条件下(2%O2)培养BeWo细胞并诱导合体化过程中,Notch3表达水平升高,BeWo细胞合体化能力受损;经Western blot检测BeWo细胞核蛋白组分,BeWo细胞核内N3ICD水平在缺氧条件下升高,缺氧增强了N3ICD转移入核的能力;通过ELISA检测BeWo细胞培养基中sFLT1,结果显示:缺氧增加了BeWo细胞合体化过程中sFLT1蛋白的分泌。五、N3ICD过表达小鼠模型呈现人子痫前期特征利用Ad-N3ICD腺病毒构建体内Notch3过表达孕鼠模型,在小鼠怀孕第6天(GD6)通过尾静脉注射腺病毒,通过检测孕鼠孕期血压、尿蛋白、血清中sFLT1水平变化及胎儿体重,明确Notch3对孕鼠妊娠结局的影响及验证Notch3对子痫前期发生的影响。结果显示:于GD6注射Ad-N3ICD后,孕鼠胎盘中N3ICD的mRNA水平升高,成功构建Notch3过表达孕鼠模型;Notch3过表达孕鼠的血压,尿蛋白及血清中sFLT1蛋白水平均于注射Ad-N3ICD后发生上调,GD18天的胎儿体重降低,成功模拟出人子痫前期特征。综合以上结果,本研究发现Notch3在滋养细胞合体化过程中发生表达下调,缺氧通过增加Notch3表达并促进N3ICD入核调控细胞周期,影响滋养细胞自我更新及分化平衡,从而抑制滋养细胞合体化并参与子痫前期发展。