论文部分内容阅读
寒冷环境是北方寒区内动物不可避免的应激源之一,极易引发机体产生冷应激反应。而在寒冷环境下骨骼肌能够增强自身代谢和收缩产热以维持体温平衡,对机体健康甚至存活至关重要。O-GlcNAc糖基化修饰是一种非典型的、高度动态和可逆的蛋白翻译后修饰,通过调控靶蛋白的活性、定位、互作和稳定性等广泛参与各类生理进程,如信号转导、免疫、炎症、凋亡和自噬等。同时,O-GlcNAc糖基化修饰能够在多种细胞应激反应和能量代谢紊乱中充当“应激感受器”和“营养传感器”来维持细胞正常生理功能。此外,有研究表明O-GlcNAc糖基化修饰与胰岛素敏感性、葡萄糖代谢稳态、骨骼肌收缩和结构特性等调控密切相关。而本课题组前期研究发现骨骼肌特异性OGlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）敲除小鼠在间歇性冷处理后骨骼肌萎缩现象明显。那么,间歇性冷处理小鼠骨骼肌的能量代谢、形态功能和O-GlcNAc糖基化修饰间有何变化?其具体调控关系如何?在间歇性冷处理期间O-GlcNAc糖基化修饰又能否作为“应激感受器”和“营养传感器”来发挥细胞保护作用?上述问题于动物冷应激的研究领域中尚属空白。因此,本研究旨在探究O-GlcNAc糖基化修饰对间歇性冷处理小鼠骨骼肌能量代谢和形态功能的影响并进一步剖析其调控机制。本研究能够为防治畜牧业冷害提供理论依据,保障动物健康,提高肉品质,增加经济效益。同时,本研究具有较强的地域特色,对寒区人类健康和畜牧业发展具有十分重要的理论和实践意义。为探讨O-GlcNAc糖基化修饰对间歇性冷处理小鼠骨骼肌能量代谢和形态功能的影响,本研究构建了骨骼肌特异性Ogt敲除（Ogt mKO）小鼠,给予Ogt mKO小鼠和野生型小鼠每天3 h为期1 w的4℃间歇性冷处理。检测各组小鼠血液生理生化指标和骨骼肌中全局O-GlcNAc糖基化修饰水平及OGT、OGA表达;开展高、低速跑步力竭运动测试并利用HE、Masson、Tunnel染色和扫描、透射电镜等观察各组小鼠骨骼肌形态结构;开展葡萄糖和胰岛素耐量试验并检测各组小鼠空腹血糖和胰岛素水平;检测各组小鼠骨骼肌中糖原、ATP、UDP-GlcNAc含量和AKT及其下游葡萄糖代谢相关蛋白如AS160、GLUT4、GSK3β、GS、PFKFB2等;检测各组小鼠骨骼肌组织中mTOR、AMPK及其下游自噬相关蛋白如ULK1、Beclin1、ATG5、SQSTM1、LC3表达和泛素-蛋白酶体降解相关蛋白Atrogin-l、MuRF-1及全局泛素修饰水平、肌生成蛋白Myogenin。结果显示,间歇性冷处理Ogt mKO小鼠肝脏、肾脏和免疫功能出现不同程度抑制,腓肠肌、比目鱼肌湿质量比和运动能力下降（P＜0.05）,肌纤维排列混乱、皱缩、空泡变性和横切面积下降（P＜0.001）而纤维化增加（P＜0.001）,细胞凋亡和MDA含量增加（P＜0.001）而总抗氧化能力下降（P＜0.05）,空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数增加（P＜0.001）而胰岛素敏感指数下降（P＜0.01）,ATP和糖原含量下降而UDPGlcNAc含量增高（P＜0.001）,AKT活化及其下游GLUT4、AS160、GSK3β表达增强而GS、PFKFB2表达减弱,mTOR抑制、AMPK激活及其下游ULK1、Beclin1、ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比升高而SQSTM1下降,Atrogin-l、MuRF-1、Myogenin和全局泛素化修饰水平显著增加（P＜0.01）。同时,本研究首次发现了间歇性冷处理小鼠骨骼肌中SQSTM1可与OGT互作进而发生O-GlcNAc糖基化修饰。该部分研究内容表明骨骼肌Ogt缺失引起间歇性冷处理小鼠全身性胰岛素抵抗和葡萄糖代谢稳态失衡,激活自噬通量和泛素降解从而破坏小鼠骨骼肌形态结构和运动功能进而诱发了萎缩。为了进一步探究亚低温下O-GlcNAc糖基化修饰能否发挥“营养传感器”作用感应细胞葡萄糖可用性进而调控细胞自噬通量,本研究以C2C12小鼠成肌细胞系为研究对象,分别在高糖和低糖条件下进行3 h、6 h、9 h和12 h的32℃亚低温处理。检测各组细胞中全局O-GlcNAc糖基化修饰水平和OGT、OGA表达以及自噬相关蛋白如ULK1、Beclin1、ATG5、SQSTM1、LC3表达。检测各组细胞中ATP、ADP、AMP以及其培养基中残余葡萄糖含量。结果显示,葡萄糖供应不足显著抑制了全局O-GlcNAc糖基化修饰水平及OGT、OGA表达（P＜0.01）,并显著增强ULK1、Beclin1、ATG5表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比而减弱SQSTM1表达（P＜0.05）。亚低温下ATP/（ADP+AMP）水平和培养基中残余葡萄糖含量持续性降低而ATP、ADP、AMP呈现时序性波动。葡萄糖代谢组学分析结果显示,亚低温处理3 h后细胞中糖酵解和三羧酸循环相关代谢物不同程度增加,而c AMP显著降低（P＜0.01）。该部分研究内容表明32℃亚低温导致C2C12细胞能量水平下降、葡萄糖消耗增加和糖酵解增强,而O-GlcNAc糖基化修饰能够感知并响应葡萄糖可用性进而调控C2C12细胞自噬通量。为了进一步探究亚低温下O-GlcNAc糖基化修饰能否发挥“应激感受器”作用维持细胞能量稳态并抑制自噬通量和泛素降解从而发挥细胞保护作用,本研究以C2C12小鼠成肌细胞系为研究对象,利用Thiamet G和Alloxan分别增强和减弱全局O-GlcNAc糖基化修饰水平并给予3 h的32℃亚低温处理。检测各组细胞中全局O-GlcNAc糖基化修饰水平、OGT和OGA表达。检测各组细胞中GLUT4表达、膜转位和糖酵解通量。检测各组细胞中自噬相关蛋白如ULK1、Beclin1、ATG5、SQSTM1、LC3表达和泛素-蛋白酶体降解相关蛋白Atrogin-l、MuRF-1、Myogenin和全局泛素化修饰水平。结果显示,亚低温诱导全局O-GlcNAc糖基化修饰增强,进一步增强这种响应性上调能够显著促进细胞中GLUT4表达、膜转位和糖酵解通量。而亚低温下全局O-GlcNAc糖基化修饰的抑制则显著增加细胞自噬通量和泛素降解。同时,本研究双重验证了SQSTM1的OGlcNAc糖基化修饰。该部分研究内容表明亚低温诱导O-GlcNAc糖基化修饰增强进而促进C2C12细胞葡萄糖摄取和糖酵解并抑制自噬通量和泛素降解。综上所述,骨骼肌Ogt缺失引起间歇性冷处理小鼠全身性胰岛素抵抗和葡萄糖代谢稳态失衡,激活自噬通量和泛素降解从而破坏小鼠骨骼肌形态结构和运动功能。32℃亚低温处理诱导细胞能量水平降低、葡萄糖消耗和糖酵解增强,而O-GlcNAc糖基化修饰可感应葡萄糖可用性从而调控自噬通量。32℃亚低温处理诱导O-GlcNAc糖基化修饰增强以促进细胞葡萄糖摄取和糖酵解并抑制自噬通量和泛素降解从而实现细胞保护作用。