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花鳗鲡(Anguillamarmorata),英文名为Marbled eel,隶属于鳗鲡目鳗鲡科鳗鲡属,是中国国家Ⅱ级保护野生动物。在我国该鳗鲡主要分布于海南、福建及广东沿海江河,近年来,我国花鳗鲡养殖发展速度较快,但由于其自身习性以及该鱼目前的基础研究比较薄弱,养殖花鳗鲡的苗种来源只能依靠天然捕捞的鳗苗,且鳗苗培育成活率较低,极大地限制了花鳗鲡的养殖规模和发展。花鳗鲡作为一种典型的降海洄游性鱼类,其渗透压调节机制研究并没有受到足够的关注,在该鱼盐度适应的转录组学和蛋白质组学方面研究均未见报道。至今花鳗鲡在海水-淡水之间洄游过程面临的渗透压变化调节机制尚不清楚。本文从花鳗鲡的高通量测序转录组以及蛋白质组分析入手来探究花鳗鲡盐度适应的调节机制,包括不同盐度下RNA转录水平和蛋白表达水平两方面的变化,并着重研究Hsp90、NKCC1和HSD11B2三个关键的渗透压相关基因在花鳗鲡盐度适应过程中所扮演的角色。研究结果可充实花鳗鲡盐度适应的转录组学和蛋白质组数据库,也为进一步揭示鳗鲡属洄游型鱼类盐度适应的调节机制提供理论依据。本文研究结果主要包括以下5个部分:1.不同盐度下花鳗鲡转录组测序及分析通过Illumina二代测序平台对三个盐度(Fresh water,简称FW;Brackish water,简称BW,盐度10 ppt,Seawater,简称SW,盐度25 ppt)处理组花鳗鲡幼鳗鳃、肠、肾混合组织运用IlluminaHiSeq2500平台进行双末端高通量测序(读取片段长度为100bp)。每组获得约3300万条total reads,经过De novo组装,获得65536条contigs,与欧洲鳗鲡转录组参考序列比对后得到注释contigs 45976条。BW组及SW组分别与FW组的GO注释结果比较显示,SW组分类到每个GO类别的contigs数量均大于BW组。利用FPKM值计算差异基因RNA表达量,BW组相对于FW组上调表达1511个基因,下调表达238个基因:相应SW组与FW组比较上调表达了 2208个基因,下调表达335个。转录组数据经由KEGG pathway注释后,共有133个pathway被鉴定。注释基因个数较多的pathway有Purine metabolism、Phosphatidylinositol signaling system 和 Inositol phosphate metabolism,三个pathway包含差异表达的渗透压相关基因。从转录组中筛选7个渗透压相关基因(AQP3、NHE8、Hsp90、Hsp70、Hsc70、NBCe3 和 HSD11B2)通过RACE方法扩增cDNA全长并初步分析,设计7个基因的合适引物,通过荧光定量PCR反应检测各基因mRNA在三个盐度水平的表达量,结果表明5个基因(AQP3、NHE8、Hsp90、Hsp70、NBCe3)表达量在不同盐度下有显著变化。2.不同盐度下花鳗鲡鳃组织蛋白质组测序及分析利用iTRAQ技术对三个盐度(FW;BW,盐度10ppt;SW,盐度25ppt)处理组花鳗鲡幼鳗鳃组织进行蛋白质组分析,共鉴定到1937个蛋白,其中1560个蛋白被定量。将两个盐度(BW,SW)组的蛋白表达结果分别与对照(FW)组结果进行比较,SW组鳃组织中共有336个上调表达蛋白,相应BW组有33个蛋白上调表达。336个上调蛋白中包含Na+/K+-ATP酶、V-type质子泵、钠钾氯共转运蛋白(NKCC)和热休克蛋白90(Hsp90)等。差异表达蛋白被富集在多个 KEGG pathways 上,Oxidative phosphorylation pathway 和 Seleno-compound metabolism pathway中包含ATP的合成与分解过程。Ribosome pathway反映大量蛋白表达活动。其中 Tight junction pathway 和 Cardiac muscle contraction pathway可能与鳃细胞中离子转运相关。这些研究结果为花鳗鲡渗透调节挖掘了可能的新的互作蛋白和代谢通路。3.Heat shock protein 90(Hsp90)应对盐度变化的表达研究利用荧光定量PCR和Western Blot技术手段检测花鳗鲡幼鳗进入两个不同盐度(BW,盐度10 ppt;SW,盐度25 ppt)环境后,随着时间变化鳃组织中Hsp90 mRNA和蛋白表达量的变化,结果显示:花鳗鲡的鳃组织在进入BW环境和SW环境后mRNA与蛋白表达量趋势有较大差异。对比两个盐度水平下不同时段的mRNA和蛋白表达量有着相关性。因此推测Hsp90可能参与了细胞内的渗透压调节过程,对花鳗鲡鳃组织适应盐度变化过程起到相应的作用。Hsp90在鱼体进入SW中后的上升表达发生在24h以后,说明在高盐度的SW环境中,Hsp90的变化并非发生在盐度变化后的短时间内。4.Na-K-2C1协同转运蛋白1(NKCC1)应对盐度变化的表达研究利用荧光定量PCR和Western Blot的技术手段检测花鳗鲡幼鳗进入两个不同盐度(BW,盐度10ppt;SW,盐度25 ppt)环境后,随着时间变化鳃组织中NKCC1 mRNA和蛋白表达量的变化。结果显示:花鳗鲡幼鳗在进入BW后NKCC1 mRNA分别在6h和48h达到两个极显著峰值,在进入SW后在6h达到极显著峰值,并且表达量高于BW组。蛋白表达量在BW中的趋势与mRNA表达量趋势相近,而进入SW后的蛋白表达量偏低。推测在高盐度下NKCC1参与的盐度适应调节机制相比低盐度时发生了变化。可见,花鳗鲡NKCC1在应对高盐度时的调节机制与其他广盐性鱼类不同。5.皮质类固醇11-beta脱氢酶Ⅱ(HSD11B2)应对盐度变化的表达研究利用荧光定量PCR和Western Blot的技术手段检测花鳗鲡幼鳗进入两个不同盐度(BW,盐度10ppt;SW,盐度25ppt)环境后,随着时间变化鳃组织中HSD11B2mRNA和蛋白表达量的变化。结果显示:花鳗鲡幼鳗在进入BW后,鳃组织中HSD11B2 mRNA在12h有极显著升高表达,随后便逐渐降低,直至96h表达量达到对照组水平以下。当幼鳗进入SW后,mRNA和蛋白表达量在各个时段均处于低水平表达。因此推测在BW环境中,HSD11B2可能不通过影响皮质醇活性来调节盐度适应能力。在SW环境,当鱼体应对盐度升高的变化,花鳗鲡幼鳗通过HSD11B2表达量的降低来参与盐度适应调节。