血吸虫病是联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织联合倡议“热带病特别规划”在全球重点防治的10种热带病之一,流行广泛,是目前仍严重威胁民众健康的人兽共患寄生虫病。我国仅流行日本血吸虫病。血吸虫病的主要致病因子是虫卵。血吸虫病的主要病变是成熟虫卵释放可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigen, SEA),激活宿主免疫应答系统,介导肉芽肿反应破坏宿主正常组织。近50年以来,我国血吸虫病疫情得到有效控制,相关基础性研究如日本血吸虫基因组、转录组、microRNA组学亦取得系列进展,但对病变组织中虫卵肉芽肿的治愈仍没有很好的解决方案。本文以日本血吸虫虫卵主要抗原Sjp40(Major egg antigen of Schistosoma japonicum, Sjp40)作为研究靶标分子,建立日本血吸虫感染新西兰白兔和BALB/c小鼠模型,一方面利用RNA干扰技术初步研究该分子对刚完成雌雄合抱处于配子发生期的感染后第19天(19 days post-infection,19dpi)组雌雄虫合抱的影响及对完全性成熟处于产卵高峰期的45 dpi组雌虫产卵量的影响这两方面的生物学功能；另一方面取未成熟虫卵沉积但尚未发生肉芽肿病变的29 dpi新西兰白兔肝脏组织以及大量成熟虫卵聚集并发生广泛肉芽肿急性病变期的45 dpi肝脏组织进行Sjp40的转录水平表达量测定及免疫荧光定位,并进行了初步的转录组学分析,为解析Sjp40在日本血吸虫病肉芽肿病变的发生、发展过程中的分子机制奠定基础。一日本血吸虫雌雄虫Sjp40的siRNA干扰及其初步功能研究目的研究日本血吸虫Sjp40基因的体外RNA干扰效应；初步观察Sjp40基因干扰后对处于配子发生期(19 dpi组)的雌雄虫合抱率及大量产卵期(45 dpi组)的雌虫产卵量的影响。方法1. 利用http://maidesigner.lifetechnologies.com/maiexpress/网站设计、筛选3对针对Sjp40基因编码区(CDS)的siRNA序列,阴性对照选用通用siRNA对照,所有siRNA标记FAM荧光。2. 日本血吸虫尾蚴(湖南株)自野生型阳性钉螺逸出,采用贴片法经腹部感染新西兰白兔,于感染后第19d(19 dpi)、29d (29 dpi)、34 d (34 dpi)和45 d (45 dpi)剖杀,经门静脉灌注收集成虫。3.成虫经PBS (pH7.4)冲洗3次后转入RPMI 1640完全培养基,置5% CO2,37℃培养箱培养。4.收集19 dpi、29dpi、34 dpi和45 dpi以及培养各天数的雌雄虫,备提取总RNA。5.浸泡法转染终浓度为200 nmol/L的siRNA40至19 dpi组雌雄合抱日本血吸虫成虫,同步设立阴性对照和空白对照。5% CO2,37℃,干扰3d、5d后,雌雄虫分开收集,PBS洗涤3次,备提取RNA。同步观察并统计RNA干扰5d后雌雄虫合抱情况。6. 电穿孔法转染终浓度为200 nmol/L的siRNA 40至45 dpi日本血吸虫雌雄合抱成虫,同步设立阴性对照和空白对照。RNA干扰48 h后雌雄虫体分开收集,经PBS (pH7.4)洗涤3次,备提取总RNA。同步在显微镜下观察并比较各组产卵量。7.按Trizol试剂说明书提取日本血吸虫雌虫/雄虫总RNA,经DNase Ⅰ消化,逆转录成cDNA。qRT-PCR检测Sjp40基因mRNA的表达情况。8.分离、获得45 dpi雌虫和雄虫个体各20条,分别提取总RNA,逆转录后以RT-PCR扩增单个雌虫/雄虫的Sjp40基因CDS片段,克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector中,每条虫体挑取经酶切鉴定证实的3个克隆,双向测序,利用DNAMAN软件分析Sjp40基因是否存在性别多态性。9.参考秀丽隐杆线虫RNAi效应器成分中各基因名称及该基因结构域信息,应用ncbi,uniprot, interpro, pfam数据库,寻找日本血吸虫的RNAi效应器成分。10.用IBM SPSS 19.0统计软件和GraphPad Prism 5作图软件进行数据分析,实验数据中3组以上计量资料均数之间的比较用ONEWAY-ANOVA方差分析方法进行统计学检验,实验组和对照组间计量资料均数比较用Student’t -test进行统计学检验,RNA干扰后组间合抱率的比较采用Kruskal-Wallis Test进行统计学检验。p<0.05认为差异有统计学意义,P>0.1认为差异没有统计学意义。结果1.日本血吸虫雌雄合抱后的发育进程中,雄虫Sjp40基因的转录水平在本研究检测各点中呈稳定性低表达；雌虫Sjp40基因的转录水平在本研究检测各点中波动较大,主要表现在19dpi雌雄合抱成虫体外培养第2d和第3d时,雌虫Sjp40基因的转录水平处于和雄虫同样的较低水平,而在培养的第5d和第9dSjp40基因的转录水平显著增加,29 dpi组、34 dpi组和45 dpi组雌虫Sjp40基因的转录水平均显著高于雄虫,且在此较高水平上有一定波动。2.浸泡法递送siRNA干扰19 dpi组雌雄合抱成虫中Sjp40 mRNA表达,干扰效应呈现性别差异：以阴性对照组为基线,雌虫Sjp40 mRNA水平在RNA干扰后的第3d无显著下降,第5d下降-60%；而雄虫Sjp40 mRNA水平在RNA干扰后的第3d和第5d均未出现显著下降。siRNA40干扰组、阴性对照组和空白对照组间的雌雄合抱率在干扰后第5d无显著性差异。3.电穿孔法递送siRNA干扰45 dpi雌雄合抱成虫中Sjp40 mRNA表达,干扰效应亦呈现性别差异：以阴性对照组为基线,雌虫Sjp40 mRNA水平在RNA干扰48 h后下降～55%；而雄虫Sj40 mRNA水平变化在RNA干扰前后无显著性差异。显微镜下初步观察到：RNA干扰48 h后,与阴性对照组相比,siRNA40实验组的雌虫产卵量明显减少。4.日本血吸虫雌虫/雄虫各20条的Sjp40基因克隆测序结果显示：Sjp40基因CDS区高度保守,一致性为100%。5.参照模式生物秀丽隐杆线虫,日本血吸虫所具有的RNAi效应器成分(小RNA生物合成,dsRNA摄入、扩散,放大效应蛋白,Argonautes和RISC, RNAi抑制蛋白,核RNAi效应器)种类齐全,但每类RNAi效应器的数量减少。结论1.日本血吸虫雌虫Sjp40转录水平在19 dpi雌雄合抱成虫体外培养第5d开始迅速增加,其后各检测点中一直处于高表达,且显著高于雄虫Sjp40转录水平。在siRNA40成功降低45 dpi组雌虫Sjp40表达后,初步观察到雌虫产卵量明显减少,提示雌虫Sjp40基因与雌虫产卵密切相关。2. siRNA40干扰配子发生期(19 dpi组)雌虫Sjp40基因后,初步发现雌虫Sjp40与雌雄合抱无明显相关性。3.RNA干扰19 dpi组和45 dpi组雌雄合抱成虫,雌、雄虫的Sjp40 RNA干扰效应均存在明显的性别差异。4. Sjp40 RNA干扰效应性别差异的发生与Sjp40基因水平性别多态性无关。二日本血吸虫感染动物模型肝脏肉芽肿病变进程Sjp40表达与免疫定位及其初步组学分析目的观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况及其免疫定位；对日本血吸虫感染动物模型肉芽肿病变进程中的肝脏组织进行初步组学分析。方法1.日本血吸虫尾蚴(湖南株)自野生阳性钉螺逸出,采用贴片法经腹部感染新西兰白兔和BALB/c、鼠,于感染后第29 d和45 d剖杀,收集未感染组、29dpi组和45 dpi组肝脏,未感染肝脏作为空白对照。2.液氮快速研磨上述各期新西兰白兔和BALB/c小鼠肝脏成粉末状后,分别加入Trizol,按TRIzol法提取各期肝脏总RNA,经DNase Ⅰ消化,逆转录成cDNA。RT-qPCR检测各期兔肝脏中Sjp40基因mRNA的表达。各期BALB/c小鼠肝脏RNA送公司进行转录组测序；3.同步提取各期新西兰白兔肝脏可溶性总蛋白(total soluble protein, TSP).以硫酸铵盐析法和Protein G免疫亲和柱层析法纯化抗Sjpp40-McAb 9G7(检测抗体)和抗弓形虫tSAGl-McAb Y3A8(阴性对照抗体),Western-blot检测Sjp40蛋白的表达。4.制备各期新西兰白兔肝脏石蜡切片,HE染色观察肝脏中虫卵肉芽肿的形成与发展,进一步以间接免疫荧光技术进行Sjp40在肝脏沉积虫卵及肉芽肿组织中的定位。5.统计学处理,用IBM SPSS 19.0统计学软件进行统计分析,29 dpi组和45 dpi组两组兔肝脏沉积虫卵间Sjp40的mRNA表达水平差异采用独立样本t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.日本血吸虫感染兔呈急性肝肉芽肿病变期的45 dpi肝脏沉积虫卵中Sjp40mRNA水平显著高于29 dpi尚未形成虫卵肉芽肿结节的肝脏沉积的未成熟虫卵(P<0.05)。2.抗Sjp40-McAb 9G7特异性检测到Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi新西兰白兔肝脏中的表达。3.HE染色片观察显示29 dpi新西兰白兔肝脏中虫卵极少,且皆为未成熟虫卵,尚未见虫卵肉芽肿形成,但肝脏已有轻微病变；45 dpi新西兰白兔肝脏中则显示有成熟虫卵大量成簇沉着,虫卵肉芽肿广泛分布。4.间接免疫荧光结果显示：Sjp40在29 dpi新西兰白兔肝脏中定位于未成熟虫卵内,而45 dpi,可见感染新西兰白兔肝脏中沉积的大量成簇内含毛蚴的成熟虫卵及其周围肉芽肿组织均有明显荧光。5.转录组学初步结果显示：29 dpi BALB/c小鼠肝脏比对到小鼠基因组(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html#mouse)和日本血吸虫基因组(http://lifecenter.sgst.cn/schistosoma/cn/schdownload.do)的mapped reads分别为105,021,590(91.47%)和43,117(1.5%)条。测序共获得日本血吸虫已知转录本为4238个,新转录本为221个。其中测序深度大于10且表达量大于500的日本血吸虫已知转录本为10个,其中Sjp40表达量居首位。6.统计学处理,用IBM SPSS 19.0统计学软件分析,29 dpi组和45 dpi组两组兔肝脏沉积虫卵间Sjp40的mRNA表达差异采用独立样本t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结论1.Sjp40在日本血吸虫感染兔肝脏中的表达量随虫卵发育成熟而显著增加,并由虫卵扩散至其周围肉芽肿组织,提示该分子在血吸虫肉芽肿的形成与发展过程中具有重要作用。2.29 dpi BALB/c小鼠肝脏转录组学初步分析结果显示,Sjp40在测序深度大于10且表达量大于500的转录本中呈最高量表达,进一步提示Sjp40应在29 dpiBALB/c小鼠肝脏沉积虫卵中扮演重要角色。