背景Cell-in-cell(简称CIC)现象,是指一个或多个细胞在另一个细胞胞质内,且保持完整的细胞膜结构的现象,从发现至今已有100多年历史。对于它的认识也经历了从一开始被认为仅仅是偶然事件,到如今承认它确实具有广泛的生物学意义。在今天,越来越多的人投入到了CIC的研究中,对于CIC的认知更加系统清晰,研究方法也日渐成熟。目前,依据参与的细胞类型不同可以将CIC结构粗分为两类：同质的CIC结构和异质的CIC结构。所谓同质的CIC结构,指形成CIC的细胞均为同种类型的细胞,如上皮细胞与上皮细胞之间。这种现象往往出现在肿瘤细胞之间。异质的CIC结构是指形成CIC的细胞来源于不同种类,如肿瘤细胞与免疫细胞之间(如NK细胞、T细胞、B细胞),免疫细胞钻入到肿瘤细胞内部,也被称作“钻瘤”。研究发现,CIC结构中内部细胞往往死亡,但死亡机制尚不完全明了,其中部分是通过非凋亡途径,主要是由外侧细胞溶酶体参与的细胞死亡过程,构成一种全新的死亡机制。就同质CIC而言,目前已研究发现一种新的死亡机制,研究者将其命名为"entosis",是指上皮来源的细胞之间首先形成的CIC结构,内部细胞被来源于外部细胞的细胞膜包裹,呈囊泡状。然后外部细胞LC3于囊泡膜表面富集,并在ATG5、ATG7、VPS34等分子作用下脂质化,招募靶细胞的溶酶体蛋白LAMP1和蛋白酶CathepsinB。这些分子进入囊泡,对内部细胞产生溶酶体溶解作用,导致内部细胞死亡。有报道称CIC的形成与机体形成免疫耐受有关。同时我们的研究表明CIC结构的形成与肿瘤的发生发展有着密切关系。其重要性可见一斑。为了更近一步了解CIC的生物学功能,我们有必要研究其形成的机制。而对于形成机制的研究则应该遵循人的认知规律——在细节中认识整体,在整体中把握细节。只有细节层面与整体层面有机统一,才能够充分地、客观地认知事物。对于细节层面而言,需要落实在具体的基因或生物分子上。在之前的研究中我们发现E-cadherin和P-cadherin的缺失,会明显抑制肿瘤细胞之间形成CIC结构；而恢复E-cadherin和P-cadherin的表达,肿瘤细胞之间则会重新形成CIC结构。众所周知,E-cadherin和P-cadherin都是细胞间相互黏附、连接的重要分子,这向我们提示细胞间的黏附、连接似乎和CIC结构的形成有关。着眼于细胞间黏附、连接的相关分子,我们将研究目标定位为α-catenin,它位于细胞膜表面粘附分子与细胞内F-actin之间,通过自身结构域将二者连接,从而形成稳定的细胞间连接。对于整体层面而言,需要建立、健全一个系统的认知体系。虽然人类对于cell-in-cell的研究已有100多年历史,但至今仍处于起步阶段。对于cell-in-cell结构如何形成,研究者们更是众说纷纭：有人认为是被动发生的,不需要耗能；而有人则认为是主动发生的,需要耗能；有人认为是内部细胞主导的“钻”的过程;有人认为是外部细胞主导的“吞”的过程……造成这一现象的主要原因是实验数据纷繁复杂,且规律难寻。因此,一个完整的、可靠的模型对后续研究尤为重要。但我们并不奢望能够建立起一个对cell-in-cell结构形成过程完全正确、客观的模型,因为基于目前的研究现状及技术制约,完全认识cell-in-cell还是天方夜谭。但如果能建立一个相对完整的模型框架,并总结目前已有的研究成果,以此为基础提出某些设想或推论,为之后的研究指明方向亦或是提供些须帮助,那么这样的模型就有一定意义。目的1.研究a-catenin对cell-in-cell结构形成的影响；2.探讨a-catenin影响cell-in-cell结构形成的作用机制；3.综合已有数据初步建立cell-in-cell结构形成过程的模型。方法在之前的研究中我们发现：有些肿瘤细胞即便高表达E-cadherin、P-cadherin,但CIC形成率却很低,而这些肿瘤细胞往往低表达α-catenin。为了更进一步了解α-catenin与CIC的关系,我们首先构建携带α-catenin基因的逆转录病毒质粒pQCXIP-EGFP-α-catenin质粒,包装病毒,并利用病毒将外源性α-catenin基因转入到不表达α-catenin分子的肿瘤细胞中,得到能够稳定遗传α-catenin基因的肿瘤细胞系；并利用RNA干扰技术特异性敲低高表达α-catenin的细胞。观察转染前后这些细胞生长形态与CIC形成率的变化。再通过免疫荧光染色的手段特异性标记α-catenin分子以及与之密切相关的其他分子,如E-cadherin、Tubulin、F-actin。在激光共聚焦显微镜下观察这些分子的分布,尝试通过α-catenin转染前后这些分子分布模式的改变探讨其作用机制。对于建立cell-in-cell结构形成过程的模型而言,生物作用纷繁复杂,参与不同过程甚至同一过程的生物分子也各不相同。如果只基于生物实验的结果,则会使建立合适的模型并非易事。相对而言,物理作用基于普遍适用的公理或定理,针对现象做出的物理层面的一般解释,相对具有更好的普遍性。因此,首先从物理角度入手,建立cell-in-cell结构形成的一般物理模型,再拟合已有的实验结果、相关生物通路,经归纳、推演后得到完整的生物基本模型。结果1. Alpha-catenin缺失的肿瘤细胞之间cell-in-cell结构形成能力缺陷我们发现有一些细胞即便高表达E-cadherin分子,但却很难形成cell-in-cell结构,如MDA-MB-468、MDA-MB-436、ZR75-1、H820、H441。这提示我们除了细胞膜表面的粘附分子以外,影响cell-in-cell结构形成的还有其他分子。为了找出这些分子,我们从细胞间粘附连接相关的分子入手,以α-catenin、β-catenin、 γ-catenin为目标分子进行Western Blot实验。结果显示MDA-MB-468、H820均表达E-cadherin,不表达α-catenin,而这两种细胞系cell-in-cell结构形成率显著低于MCF7、MCF10A,这提示α-catenin的缺失将会抑制肿瘤细胞之间形成cell-in-cell结构,α-catenin很有可能是除E-cadherin等细胞膜表面粘附分子以外,其他影响cell-in-cell结构形成的分子。2.建立细胞间粘附连接需要α-catenin表达我们将外源α-catenin基因转入原本不表达α-catenin的肿瘤细胞中(MDA-MB-468、H820),对比转染前后细胞的生长状态,发现转染前细胞呈单个、松散状分布,而转染后细胞则明显聚团。这说明缺失α-catenin会抑制细胞间粘附连接的建立,而表达α-catenin后粘附连接重新被建立。3.表达α-catenin促使cell-in-cell结构形成MDA-MB-468、H820在转入α-catenin基因后二者的cell-in-cell结构形成率明显上升。但相比较容易形成cell-in-cell结构的其他肿瘤细胞(MCF7、MCF10A)而言,MDA-MB-468、H820的cell-in-cell结构形成速率却很慢,往往需要36 h,而MCF7、MCF10A仅需4-6 h。4. Alpha-catenin的缺失将导致细胞间粘附程度与cell-in-cell结构形成率下降为进一步证明α-catenin的缺失会抑制细胞之间cell-in-cell结构形成,我们选择容易形成cell-in-cell结构的MCF10A细胞系,并使用siRNA特异性敲低α-catenin的表达。结果显示原本成团、聚集生长的MCF10A细胞变得松散,细胞与细胞之间的粘附连接被破坏；cell-in-cell结构形成率显著下降。5. Alpha-catenin表达的细胞细胞骨架发生重构F-actin是重要的细胞骨架分子。免疫荧光染色实验显示：F-actin在未转染α-catenin的MDA-MB-468、H820细胞中呈弥散状均匀分布于细胞质中;而转染后F-actin则聚集于细胞膜附近。转染前后,E-cadherin与F-actin呈现出相同的分布模式,不同的是E-cadherin在转染后分布于细胞膜上。6. Alpha-catenin表达促进F-actin成束并在细胞膜附近富集使用ImageJ软件分析免疫荧光染色后样本的荧光强度,发现细胞F-actin的分布模式在转染α-catenin前后正好相反。不表达α-catenin时,细胞内部F-actin荧光信号强,细胞膜处信号弱;而表达α-catenin后,细胞内部F-actin荧光信号弱,细胞膜处信号强。同时在激光共聚焦显微镜下观察到：表达α-catenin后细胞F-actin明显聚集成束。这种现象在H820细胞系中尤为明显。结论Alpha-catenin的缺失会抑制肿瘤细胞之间形成cell-in-cell结构。其机制可能是：α-catenin是细胞间粘附连接的重要分子,缺失该分子将导致细胞间难以形成粘附连接。而粘附连接的形成又是cell-in-cell结构形成的必经阶段,因为粘附连接无法形成,所以导致cell-in-cell过程无法进行。因为α-catenin的表达会促使原本散在分布的F-actin成束,通过连接E-cadherin与F-actin重构细胞骨架。所以导致细胞刚性增强,即不易发生形变。而cell-in-cell的形成需要外部细胞产生较大形变以包裹内部细胞。在cell-in-cell结构形成过程中,刚性强的细胞则需要更多的时间重排细胞骨架,以提供所需的形变。这就可以解释为什么MDA-MB-468、H820形成cell-in-cell结构需要更长的时间。模型简述1.两细胞间形成稳定且可变的固相附着,即着力环,是cell-in-cell能够形成的决定因素之一；2. 同一细胞内部肌球蛋白收缩能力不对称且差异足够大是cell-in-cell结构形成的重要驱动因素；3.细胞主动变形能力与被动变形能力决定其在cell-in-cell结构中是内部细胞还是外部细胞,即身份。