背景肿瘤分子标志物的研究伴随了肿瘤研究的整个历程,一直是肿瘤研究经久不衰的课题。理想的肿瘤分子标志物应具有以下几个特征：1、样本容易并且可重复获得；2、可用于早期诊断；3、可预测肿瘤的治疗敏感性；4、可预测预后；5、可监测疗效,提示复发或转移,以便及时调整治疗方案。由于外周血检测具有无创、可重复、可于同一时间点进行检测多项指标等优点,一直是肿瘤分子标志物研究的方向。以往的研究发现基因、蛋白的改变特异性较差,同时基因或蛋白的改变主要集中于肿瘤细胞,由于蛋白质分子量较大,运输至细胞外,尤其是血液或体液中较晚,很难在早期从血液样本或体液中得到变化结果,极难重复获得,也就难以成为理想的肿瘤分子标志物。MicroRNA (miRNA)是近年来新发现的一类大小约为18～25个核苷酸(nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,通过与靶基因mRNA的3’非编码区(3’ untranslated region,3’UTR)不完全互补配对,在转录后水平抑制基因表达。目前研究表明50%以上的miRNA定位在肿瘤相关基因组区域(包括杂合子缺失区、染色体扩增区和脆性位点等),不但扮演原癌基因或抑癌基因的角色,还通过多条信号通路调控肿瘤的浸润和转移,广泛的参与了肿瘤的发生和发展。由于miRNA几乎参与了肿瘤发生发展中的每一个步骤,在肿瘤发病机制中发挥了超乎想象的重要作用,因此miRNA在肿瘤的临床诊断、分型、治疗及预后判断等方面均存在良好的临床应用前景。相对于肿瘤组织miRNA差异表达的研究,以血浆为代表的体液miRNA研究显示了更佳的应用前景,自2008年首次报道了1miRNA在肿瘤血浆中的表达谱与正常人相比存在显著差异,开启了血浆miRNA作为肿瘤分子标志物研究的先河,为血浆miRNA作为肿瘤分子标志物临床应用的研究开创了一个广阔的领域。正常情况下血浆中存在miRNA,可能为细胞、组织、器官之间的信息传递方式,普通正常人群的血浆miRNA表达谱变化不大,多数来源于血小板及单核细胞,通过生物信息学预测结果显示正常人群血浆中绝大多数miRNA的功能为调节细胞分化与代谢,小部分调节免疫功能,目前基本公认血浆中miRNA主要由细胞分泌微泡释放入血,意义在于信号转导,传递生物信息。肿瘤细胞也可通过微泡主动释放miRNA入血,随之其表达谱可发生变化,由于血浆中miRNA分子量小且被微泡保护,稳定性好,重复性高,研究表明细胞外miRNA在系统信号通路网络中起着重要的联系和调节作用,早于基因及蛋白的变化,其发生也早于细胞恶变、转移,可能与肿瘤发病、转移、免疫耐受、特异性器官转移有关。血浆miRNA作为肿瘤分子标志物有以下优点：1、肿瘤病人血浆miRNA表达谱有明显异常并且有组织特异性趋势；2、在血浆中稳定；3、样本容易且可反复获得；4、miRNA发生早于基因及蛋白的变化,容易早期发现。目前针对miRNA作为肿瘤分子标志物的研究刚刚起步,鉴于血液样本较组织标本容易且可反复获得,同时血浆miRNA作为肿瘤分子标志物具有以上种种优势,所以以血浆miRNA将有可能为肿瘤分子标志物的研究带来曙光,其临床应用意义前景广阔。目前血浆miRNA在肿瘤的研究集中在大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、头颈肿瘤等肿瘤中,并且已初步验证血浆miRNA作为诊断及预后指标的可行性,显示了良好的临床应用价值。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方地区最常见的恶性肿瘤之一,以明显的区域分布特征、强烈的转移倾向、与爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)感染的密切关系为显著特征。大宗临床病例观察显示鼻咽癌病人不易早期发现。而有关鼻咽癌的分子标志物研究中,EB病毒VCA-IgA、EA-IgA及血液中EBV-DNA拷贝数变化虽然在一定程度上可监测鼻咽癌疗效,但目前还没有被FDA承认的鼻咽癌诊断及预测预后的分子标志物。如何能够早期发现、预测肿瘤对治疗的敏感性、预测预后、监测复发或转移对鼻咽癌诊治疗具有及其重要的临床意义。尽管近几年来陆续有研究报道miRNA参与鼻咽癌的发病机制,但与欧美高发的乳腺癌和前列腺癌研究相比仍是九牛一毛,更为重要的是,仅有的一些鼻咽癌1miRNA研究多数集中于基础研究,少数使用了小样本的组织标本进行研究,临床意义较小,鉴于血浆miRNA在肿瘤分子标志物研究中的良好应用前景,而目前尚无鼻咽癌血浆miRNA的研究报道,本课题利用从2007年开始收集的大宗鼻咽癌病人血标本,结合详细临床资料及随访对血浆miRNA在鼻咽癌的临床应用价值展开初步探讨。材料和方法1、临床病例资料2007年12月～2011年6月在南方医院耳鼻咽喉头颈外科住院的初诊鼻咽癌病人217例,所有病例均经过病理学检查确诊,鼻咽癌组织学分型为非角化性未分化型癌或非角化性分化型癌,所有患者均尚未接受放化疗治疗。完善相关检查后依据鼻咽癌2008分期完成全部病例TNM分期及临床分期。血浆EBV-DNA定量检测由我院检验科基因检测室测定,治疗标准参照V.2.2008NCCA鼻咽癌治疗指南进行,诱导化疗疗效评定标准采用颈部化疗前后淋巴结缩小率评估,化疗副反应标准按照WHO抗癌药物急性及亚急性毒性反应标准评定,消化系统反应按0级分级,血常规以白细胞化疗前后差值衡量。全部病人跟踪随访,复诊时行电子鼻咽镜及影像学检查评估治疗效果,在抽血查EBV-DNA定量同时取得病人知情同意下再次留取血标本,共计有41例病例有复诊血标本。2、血标本收集全部患者抽取6～8mlEDTA抗凝全血,同期住院的慢性化脓性中耳炎或慢性鼻窦炎病人73例作为对照,所有患者均签署知情同意书一份。本研究通过美国NIH下属ClinicalTrials.gov临床试验注册审查批准,批准号NCT01171235,并通过南方医院伦理委员会批准。3、血浆标本分离与保存参考863课题(鼻咽癌的分子分型和个体化诊疗,课题号2006AA02A404)临床病人血标本收集指南,在4个小时内分离白细胞及血浆后于-80℃低温冰箱保存并由专人负责登记。4、荧光定量PCR检测抽提血浆总RNA,逆转录成cDNA后,U6 snRNA为内参照,Cel-miR-39为阳性对照,H2O为阴性对照,筛查21个血浆miRNA表达情况,采用sybr green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△Ct值代表miRNA的相对表达强度。5、统计学分析血浆EBV-DNA与性别、化疗消化道副反应、T、N、M、临床分期,化疗消化道副反应与化疗方案采用多(两)独立样本非参数检验；诱导化疗前后颈部淋巴结缩小率及白细胞下降量采用单因素方差分析,多重分析采用LSD法；两组间年龄采用独立样本t检验；性别采用,检验；以△Ct作为血浆miRNA统计指标,两组间采用协方差分析,性别之间以及EBV-DNA按阴性及阳性分为两组后5个血浆miRNA差异均采用两独立样本t检验；5个血浆miRNA与年龄、化疗前后淋巴结缩小率、化疗前后WBC变化相关性分析采用Pearson相关分析；5个血浆miRNA与T、N、M及临床分期采用多(两)独立样本非参数检验；Spearman非参数相关分析5个血浆miRNA与鼻咽癌病人的T、N、M及临床分期相关性及与血浆EBV-DNA、化疗消化道副反应的相关性；采用Cox回归进行生存分析；ROC曲线分析5个血浆miRNA的单独诊断效率,以是否患病为应变量,以5个miRNA表达水平为自变量,进行二分类Logistic回归,建立回归模型,以预测概率与是否患病制作ROC曲线分析诊断效率。治疗前后5个血浆miRNA表达变化采用配对t检验,按是否生存采用两独立样本的t检验。采用SPSS13.0软件统计,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、临床资料部分(1)217例鼻咽癌男：女为2.19：1,最大77岁,最小17岁,平均年龄45.93±11.78岁；(2)采用鼻咽癌2008分期,其中Ⅰ期10例,Ⅱ期52例,Ⅲ期69例,Ⅳ期86例(17例M1)；(3)血浆EBV-DNA定量阳性率61.7%,男性病人血浆EBV-DNA阳性率较女性高,血浆EBV-DNA随T、N、M分期及临床分期增高而含量增加；(4)PF+恩度较PF及TP方案对颈部淋巴结缩小率有统计学差异,TPF+泰新生较TP方案对颈部淋巴结缩小率有统计学差异,虽然TPF方案较TP、PF方案缩小率有所提高,但可能由于样本量不足以及组间样本量差别较大,导致无统计学差异(P分别为0.063、0.292),不同诱导化疗方案对造血系统副作用及消化道副反应无统计学差异,女性病人化疗消化道反应较男性高。2、血浆miRNA筛查结果(1)筛查21个血浆miRNA的相对表达水平,最终结果miR-16、miR-21、 miR-24、miR-155、miR-378表达差异在4.05～10倍之间并有统计学差异；(2)血浆miR-21与T分期呈负相关,提示血浆miR-21可能为鼻咽癌早期表达的miRNA分子；血浆miR-16、miR-21、miR-24与N分期呈负相关性,提示血浆miR-16、miR-21、miR-24可能为鼻咽癌早期转移表达的miRNA分子；(3)血浆EBV-DNA与血浆miR-16、miR-21、miR-24、miR-155呈负相关,提示该4个血浆miRNA可能与血浆EBV存在相互调控；(4)5个血浆miRNA表达量与本组鼻咽癌病人诱导化疗疗效及副反应无相关性；(5)Cox回归生存分析提示5个血浆miRNA表达量与病人生存状态均无统计学意义,但由于本组病例绝大部分病人随访时间不到3年,结果有待进一步完善；(6)ROC曲线提示5个指标诊断效率均较好,其中血浆miR-21及miR-155最好,曲线下面积达到0.792及0.763,灵敏度及特异性均分别达到0.75及0.7；联合5个血浆miRNA或除miR-16的4个指标联合可显著提高诊断效率,曲线下面积达到0.909,灵敏度及特异性均分别达到0.877及0.802。3、随访情况(1)217例病人随访1～40个月,随访率82%,41例有治疗前后自身对照血标本,其中5例复发或转移。(2)无复发或转移的病例治疗后血浆miR-16、miR-21、miR-24、miR-155含量较治疗前显著下降(P<0.05)；(3)复发或转移病例血浆miR-21、miR-24、miR-155表达量均上升,无复发或转移病例miR-378治疗后血浆表达量均明显上升,复发或转移病例血浆表达量下降,显示了与病情基本一致的变化趋势。结论1. 鼻咽癌不易早期发现,血浆EBV-DNA阳性率较低,但随T、N、M分期及临床分期增高而含量增加。2. 新型抗血管生成及分子靶向药物在不增加毒副作用的前提下显示了良好的抗肿瘤效果。3. 与正常人比较,鼻咽癌病人血浆miR-16、miR-21、miR-24、miR-155、miR-378表达存在差异。4. 血浆miR-21可能为鼻咽癌早期表达的miRNA分子；血浆miR-16、miR-21、miR-24可能为鼻咽癌早期转移表达的miRNA分子5. ROC曲线显示5个指标单独诊断效率均较好,联合5个或排除miR-16的4个指标联合可显著提高诊断效率。6. 本组鼻咽癌病人治疗后血浆miR-21、miR-24、miR-155、miR-378动态变化显示了与病情基本一致的变化趋势,提示用于监测疗效的可能性。