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粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk为龙胆科龙胆属秦艽组植物,是我国常用中药材秦艽的主要来源之一。但粗茎秦艽种子的自然发芽率较低且不稳定,这为粗茎秦艽的栽培工作带来了困难。文献报道,秦艽种子粗提液和根粗提液浸泡处理后对不同种子萌发具有一定的影响,其内源性成分可能是影响其萌发的主要成分。本文首先收集并考察了两批云南丽江产粗茎秦艽种子的质量和萌发特性,用该实验材料建立了粗茎秦艽种子萌发过程中马钱苷酸和龙胆苦苷的高效液相(HPLC)含量测定方法,测定了这两种成分在萌发过程中的含量;其次考察了不同生药浓度的粗茎秦艽种子和根粗提液对粗茎秦艽种子萌发的影响;最后探究龙胆苦苷和马钱苷酸单体对粗茎秦艽种子萌发的影响。研究内容如下: 1.按照文献报道,以种子的净度、千粒重、含水量和发芽率为主要指标,云南丽江产2014年种子属于种子质量Ⅱ级标准,2015年种子属于种子质量Ⅳ级标准。均适用于秦艽种子生产,可作为进一步实验研究的材料。 2.建立粗茎秦艽种子萌发过程中马钱苷酸和龙胆苦苷的HPLC含量测定方法:色谱柱为Cat C18(4.6 mm×150 mm,3.5μm);流动相为乙腈(A)-0.04%乙酸水(B);梯度洗脱;流速为0.8 mL·min-1;检测波长为254 nm;柱温为30℃;进样量为5μL。马钱苷酸和龙胆苦苷的线性范围分别35.5μg·mL-1~761.5μg·mL-1(r1=1.0000)、4.8μg·mL-1~103.1μg·mL-1(r2=0.9999),线性关系良好,平均加样回收率分别为98.30%(RSD=1.91%)、99.85%(RSD=2.61%)。在种子萌发过程中,马钱苷酸含量呈不断降低的趋势,龙胆苦苷含量呈不断上升的趋势,二者呈负相关性,且相关性的程度随种子活力的衰减而下降。 3.粗茎秦艽种子粗提液中马钱苷酸浓度最高;而根粗提液中龙胆苦苷浓度最高。用两种粗提液母液配制不同浓度的溶液浸泡种子24 h后,将种子放入培养箱中21℃恒温培养,发现两种粗提液对粗茎秦艽种子萌发的影响均表现为抑制作用,但随着粗提液生药浓度提高,抑制作用的变化有所不同。 随着种子粗提液生药浓度的增大,粗茎秦艽种子的各萌发指标显著下降,抑制作用逐渐增强,生药浓度为1.0 g·mL-1的种子粗提液中马钱苷酸浓度为8.31mg·mL-1,对种子萌发的抑制作用最强。 随着根粗提液浓度增大,粗茎秦艽种子的各萌发指标下降趋势明显减缓,抑制作用逐渐减弱,生药浓度为0.2 g·mL-1根粗提液中龙胆苦苷浓度为1.64 mg·mL-1,对种子的抑制作用最弱。 结果表明,粗茎秦艽种子和根中均含有抑制粗茎秦艽种子萌发的成分;同时根中可能存在部分促进其萌发的成分。本实验为下一步内源性成分对粗茎秦艽种子萌发影响的研究中马钱苷酸和龙胆苦苷的浓度设置提供参考。 4.用7.62mg·mL-1的马钱苷酸溶液浸泡粗茎秦艽种子24 h后,种子内马钱苷酸的含量比对照(用水浸泡)仅提高了12.84%,浸泡后的种子发芽率等萌发指标与对照种子相比均没有显著性差异。 用0.89mg·mL-1的龙胆苦苷溶液浸泡粗茎秦艽种子24 h后,种子内的龙胆苦苷含量比对照提高156.76%,浸泡后种子的发芽率等萌发指标略有提高,但与对照的差异不显著。用1.78 mg·mL-1的龙胆苦苷溶液浸泡粗茎秦艽种子24 h后,种子内龙胆苦苷的含量比对照提高278.38%,种子发芽率提高了18.31%,发芽率、芽长、发芽指数和活力指数均显著性提高,结果显示1.78 mg·mL-1的龙胆苦苷溶液浸泡粗茎秦艽种子24 h后,对粗茎秦艽种子萌发具有明显的促进作用。 本实验为提高种子发芽率和进一步探究内源性成分对粗茎秦艽种子萌发的影响提供基础资料。