【摘 要】
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三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国重要的淡水养殖贝类之一,随着养殖规模的不断扩大,病害的发生也越来越频繁,给我国贝类养殖业造成了重大损失。Notch信号通路广泛存在于多细胞生物,在细胞生长、发育、分化、凋亡、组织重塑及炎症等过程中起重要的调控作用。Notch信号通路最初被认为是细胞命运的多效性调节因子,近期还发现与免疫细胞发育和功能的发挥有关。本研究克隆鉴定了3个Notch配体
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三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国重要的淡水养殖贝类之一,随着养殖规模的不断扩大,病害的发生也越来越频繁,给我国贝类养殖业造成了重大损失。Notch信号通路广泛存在于多细胞生物,在细胞生长、发育、分化、凋亡、组织重塑及炎症等过程中起重要的调控作用。Notch信号通路最初被认为是细胞命运的多效性调节因子,近期还发现与免疫细胞发育和功能的发挥有关。本研究克隆鉴定了3个Notch配体,分析了它们的结构特征;实时荧光定量分析了它们的组织表达模式和病原相关分子模式（脂多糖、肽聚糖和聚肌胞苷酸）刺激后的表达变化;运用RNAi技术敲降这些配体,检测三角帆蚌中一些免疫信号通路基因和免疫蛋白的表达变化此外体外表达了重组蛋白,分析测定了它们与细菌的相互作用。研究结果丰富人们对三角帆蚌先天性免疫的认识,为贝类健康养殖提供理论基础。1.三角帆蚌notch配体基因的克隆与分析从三角帆蚌转录组文库中筛选并克隆出3个notch配体:HcDelta like1HcDelta like2、Hc Jagged1,它们的c DNA全长分别为4117 bp、2128 bp、3123bp,预测编码786,656,616个氨基酸。生物信息学预测HcDelta like1蛋白含有1个MNNL结构功能域,HcDelta like2,Hc Jagged1中没有。HcDelta like1、HcDelta like2、Hc Jagged1都含有不同数量的EGF重复序列;HcDelta like1有3个EGF、6个EGF-CA、1个EGF-like结构域;HcDelta like2有8个EGF、2个EGF-CA结构域;Hc Jagged1有2个EGF、3个EGF-GA结构域。序列比对分析显示HcDelta-like1与地中海贻贝的同源性最高为53.18%,HcDelta-like2与加州红鲍的同源性最高位为43.22%,Hc Jagged 1与太平洋牡蛎的同源性最高为43.37%。2.Notch配体成员参与三角帆蚌免疫反应实时荧光定量PCR分析表明:HcDelta like1、Hcjagged1在三角帆蚌心、肠、肾、肌肉、外套膜、鳃、斧足、性腺8个组织中均有表达,在肾脏未检测到,HcDelta like2的表达。HcDelta-like1在闭壳肌中表达量最高,心脏中表达最低;HcDelta-like2在肠中表达量最高,闭壳肌中表达量最低;Hc Jagged1在肝胰腺中表达最高,在斧足中表达最低。LPS、PGN和Poly I:C刺激后,HcDelta like1、HcDelta like2、Hc Jagged1 m RNA在三角帆蚌肝胰腺和鳃中的表达量总体上是先下降后上升的趋势。RNA干扰实验结果表明敲降HcDelta like1后免疫相关基因BCL-2和NF-κB2表达量显著下降。血细胞中的HMGB-1、TNF-α含量显著下降;敲降HcDelta like2后NF-κB2表达量也显著下降。这些结果表明Notch配体参与了三角帆蚌免疫应答。原核表达了HcDelta like1、HcDelta like2胞外结构域,获得的重组蛋白具有结合革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力,且能够与LPS、PGN和Poly I:C结合。血细胞原位杂交结果显示HcDelta-like1,HcDelta-like2在血细胞中都有表达,在注射LPS和PGN 12h后表达量下降,24h之后表达量上升。在注射poly（I:C）之后12h和24h,HcDelta-like1,HcDelta-like2表达量均上升。
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