脓毒症是一种由感染因素引发的全身炎症性疾病,是临床上烧创伤以及感染性疾病常见的并发症。脓毒症进一步发展可导致脓毒症休克和心肾肝肺等多器官功能障碍综合症,最终导致死亡。流行病学调查显示,全球每年有脓毒症患者超过1900万,超过中风、肺癌、乳腺癌、心脏疾病等常见病的发病率。脓毒症不但发病率高,其死亡率也高居不下。调查显示,脓毒症的死亡率超过20%,而脓毒症休克的死亡率更是高达45%。然而脓毒症发病的机制仍未完全阐明,导致脓毒症的治疗未取得根本性突破,因此,对脓毒症发病机制进行研究显得十分迫切。脓毒症的本质是机体失控性炎症反应,炎性细胞被过度激活而造成致炎因子与抗炎因子的平衡失调,从而引起的失控性炎症反应。巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的核心环节,其分泌的大量炎症因子和其他炎性介质,可引起炎症的级联放大效应,进而导致失控性炎症反应和多脏器功能障碍综合征的发生。巨噬细胞内NF-κB信号通路的持续性激活,是损伤后巨噬细胞分泌过量炎症因子和炎性介质的重要分子基础。正常情况下,NF-κB位于胞浆,与其天然性的抑制因子IκB结合在一起而不能进入核内。当细胞受到内源性或外源性危险因素刺激时,可使IκB降解,促使NF-κB入核,与靶基因结合,产生大量的炎性介质,同时基因产物会进一步激活NF-κB,引起级联放大效应。因此,抑制NF-κB信号通路的活化是缓解炎症失衡的关键环节所在。对于脓毒症来说,巨噬细胞中NF-κB信号的调控是减轻失控性炎症反应,提高脓毒症生存率及改善多脏器功能障碍的重要靶点。MCPIP1是一种具有免疫调节功能的锌指蛋白家族分子,MCPIP1自从2006年被第一次发现以来,其在炎症反应中的作用就越来越受到人们的重视。MCPIP1是一种RNA酶和去泛素化酶,以往的研究主要集中在MCPIP1作为RNA酶降解mRNA抑制炎症反应和MCPIP1作为去泛素化酶去泛素化NF-κB信号通路关键分子抑制炎症反应的作用,但对其作为RNA酶降解miRNA的研究较少。通过查阅文献我们发现MCPIP1的直接靶标miRNAs包括miR-9,miR-20b,miR-21,miR-32-5p,miR-34a,miR-135b,miR-143,miR-145,miR-146a,miR-155,miR-200等。miRNAs是一类由内源性基因编码的单链RNA分子,具有高度保守性和组织特异性等特点,可通过转录或者转录后水平对靶基因进行调控,进而影响靶基因的表达。miRNAs最常见的调控方式是通过与目的基因3’UTR区结合形成完全互补,进而诱导目的基因mRNA降解,或者与目的基因3’UTR区不完全结合进而抑制目的基因的蛋白翻译过程。那么在脓毒症发展过程中,巨噬细胞中的MCPIP1是如何发挥作用?是否存在MCPIP1调控炎症反应的其他可能机制?[目的](1)在体内和体外模型中,探究MCPIP1对LPS诱导脓毒症炎症反应及相关信号通路的影响。(2)分析SIRT1在MCPIP1调控LPS诱导炎症反应及相关信号通路中的作用。(3)探究MCPIP1调控SIRT1的潜在机制。[方法和结果](1)腹腔注射LPS构建小鼠脓毒症模型。采用qRT-PCR、酶联免疫试验、病理切片等观察,显示腹腔注射LPS 6小时,可引起小鼠肝、肺、肾等器官发生明显的病理损害,同时小鼠血清中可见明显的炎症因子释放,肝肾功指标显著升高,表明脓毒症小鼠模型建立;LPS刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠RAW 264.7巨噬细胞,利用qRT-PCR等试验,显示巨噬细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα及MCP-1等在LPS刺激下显著升高,且在刺激2-6小时达到顶峰,建立体外细胞模型。(2)在体外细胞模型中,利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验,检测MCPIP1的表达。发现MCPIP1在LPS刺激后显著升高,且在刺激后2小时达到峰值,与炎症因子的变化趋势基本一致,证实MCPIP1参与了LPS诱导炎症反应的过程。(3)在细胞模型中,给予MCPIP1过表达质粒和小干扰RNA,检测MCPIP1对LPS诱导炎症反应及信号通路的影响。发现过表达MCPIP1可显著抑制炎症反应和NF-κB p65的核移位,而敲除MCPIP1可显著促进炎症反应和NF-κB p65的核移位;脓毒症小鼠模型中,尾静脉注射MCPIP1过表达质粒,利用qRT-PCR、酶联免疫试验、病理切片等试验,发现过表达MCPIP1可显著提高脓毒症小鼠的存活率,降低脓毒症小鼠血清中炎症因子的释放,降低脓毒症小鼠肝脏中炎症因子的表达,减轻脓毒症小鼠的肝脏病理损伤程度。(4)在细胞模型中,利用核浆分离试验、qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控炎症反应的机制。发现过表达MCPIP1可显著抑制NF-κB p65的乙酰化,同时显著促进SIRT1的表达,而敲除MCPIP1可显著促进NF-κB p65的乙酰化,而显著抑制SIRT1的表达。此外过表达SIRT1能够缓解因敲除MCPIP1导致的炎症反应及NF-κB p65的乙酰化改变。(5)在细胞模型中,利用荧光素酶报告基因试验、qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控SIRT1的作用机制。发现microRNA-9(miR-9)可结合SIRT1启动子的3’UTR区抑制SIRT1的表达,而MCPIP1可负性调控miR-9的合成。此外,过表达miR-9对MCPIP1导致炎症反应和SIRT1合成起拮抗作用。(6)在细胞模型中,利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹试验等,观察分析MCPIP1调控SIRT1的作用机制。发现microRNA-155(miR-155)可负性调控SIRT1的表达,而MCPIP1可负性调控miR-155的合成。此外,过表达miR-155对MCPIP1导致炎症反应和SIRT1合成起拮抗作用。[结论]MCPIP1在LPS诱导的脓毒症炎症反应中发挥了重要的作用。MCPIP1可以促进SIRT1的表达,进而抑制NF-κB p65的乙酰化,阻断NF-κB p65入核,从而负性调控LPS诱导的脓毒症炎症反应;miR-9可结合SIRT1启动子的3’UTR区,进而参与MCPIP1对SIRT1的调控;miR-155可间接负性调控SIRT1,进而参与MCPIP1对SIRT1的调控。