论文部分内容阅读
隐孢子虫是一种严重危害人和动物健康的全球性介水性人兽共患寄生原虫,广泛寄生于人、哺乳动物、鸟类、爬行类和鱼类的消化道和呼吸道中。对免疫功能低下的人和动物,隐孢子虫感染病情严重,迁延不愈,甚至危及生命。隐孢子虫病至今尚无有效的治疗药物和疫苗,亟待发展灵敏、快捷的病原检测和高效的免疫预防技术。本研究利用RT-PCR方法成功克隆了上海地区分离的微小隐孢子虫鼠基因型子孢子表面抗原CP15/60基因和卵囊壁蛋白CP41基因,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录的源自微小隐孢子虫牛基因型的基因序列比较,同源性分别为98.66 %和90.50 %。成功构建了微小隐孢子虫鼠基因型的原核重组表达质粒pET-28b(+)-CP15/60和pGEX-5x-3-CP41,实现了CP15/60和CP41基因在大肠杆菌中的表达。Western-blot分析显示,表达的重组蛋白可被兔抗微小隐孢子虫血清识别。重组蛋白经3次免疫后,SPF兔血清特异性抗体达到较高水平,表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。以纯化的重组表达蛋白CP15/60和CP41为包被抗原,分别建立了隐孢子虫病的间接ELISA诊断技术,对实验室收集保存的微小隐孢子虫兔基因型卵囊感染兔阳性血清及镜检隐孢子虫为阴性的正常兔血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA诊断技术具有较高的敏感性和特异性。系统、广泛地开展流行病学调查是有效预防隐孢子虫病的前提和基础。本研究对上海市某猪场不同日龄的仔猪进行了隐孢子虫病感染情况调查,共检测1 629份粪样,感染率为31.55 %。一年中,冬、春两季感染率最高、秋季次之,夏季最低。猪感染率与日龄相关,其中30 d -39 d和40 d -49 d两个日龄段的感染率最高,分别为58.54 %和43.30 %。30日龄以下仔猪和90日龄以上育肥猪的隐孢子虫感染率较低。隐孢子虫感染强度与猪龄密切相关,猪龄越小,感染强度越大。上述工作的开展,为逐步掌握上海地区猪隐孢子虫病流行状况和特点提供了基础,对于进一步防控该病具有重要意义。隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60和卵囊壁蛋白CP41基因的成功克隆和表达,以及隐孢子虫间接ELISA诊断技术的建立,为进一步开展隐孢子虫病血清学调查、利用重组抗原进行免疫预防研究提供了条件。