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试验以团头鲂(Megalobrama amblycephalaa)作为模式动物,通过高脂诱导肝胰脏脂肪沉积,以中草药黄连素作为外源性脂肪代谢调控剂,探讨黄连素对团头鲂生长性能、免疫性能、抗氧化性能、细胞凋亡及脂肪代谢性能的影响;结合体外细胞试验,进一步探究黄连素的生物安全性并验证其调脂性能。本试验分为以下三个方面的内容:第一章黄连素对高脂投喂的团头鲂生长性能、免疫性能和抗氧化性能的影响为探讨黄连素对团头鲂生长性能、免疫性能及抗氧化性能的影响,试验选取均重为(80.00±0.90)g的团头鲂320尾,随机分于16个网箱中,分别以4种不同的试验日粮(正常脂肪日粮、正常脂肪日粮+50mg/kg黄连素、高脂日粮、高脂日粮+50mg/kg黄连素,其中正常脂肪日粮脂肪含量为5%,高脂日粮脂肪含量为10%)投喂8周,即四组(ND组、NDB组、HD组、HDB组)四重复。养殖试验结束后随即进行为期5天的氨氮应激试验。结果显示,在试验日粮中添加黄连素后,正常脂肪日粮添加黄连素组的增重率(WG)及特定增长率(SGR)均显著高于其它各组(P<0.05),饵料系数(FCR)则呈现出相反的趋势;黄连素的作用虽能在一定程度上提高高脂组的增重率,但是差异不显著(P>0.05)。高脂组的各项免疫参数包括酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LYZ)和蛋白补体C3、C4均显著低于对照组(P<0.05),黄连素的作用能够明显提高以上各参数的水平(P<0.05),但是在正常脂肪日粮中作用却导致了上述各指标含量有所下降(P>0.05);与对照组相比,高脂日粮组的肝胰脏抗氧化指标包括丙二醛(MDA)、蛋白羰基(PC)及脂质过氧化物(LPO)均显著增加(P<0.05),黄连素能够通过增强超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P<0.05)和提高其总巯基(T-SH)水平(P<0.05)来缓解高脂摄入诱导的过氧化反应,同时它还能有效地减轻高脂饲喂导致的肝细胞过度凋亡现象(P<0.05)。然而在正常脂肪日粮组添加黄连素却导致了 一定程度的应激反应(P>0.05)。在氨氮应激试验中,高脂日粮添加黄连素组的累计死亡率明显低于其它各组(P<0.05)。以上结果表明,黄连素的添加能够有效提高团头鲂的生长性能,缓解高脂投喂所致的免疫力下降,抑制高脂摄入诱发的过氧化反应,同时改善逆性条件下的过度细胞凋亡。第二章团头鲂GPR43基因克隆、组织分布及黄连素对其mRNA表达量的影响为探讨黄连素对G蛋白偶联受体43(GPR43)mRNA表达量的影响以及对高脂投喂下团头鲂脂肪代谢性能的调控作用,试验设计与养殖管理同试验一。试验采用RACE技术克隆了团头鲂GPR43基因的cDNA序列,并探究了不同组织中的GPR43 mRNA表达量及不同日粮饲喂下团头鲂的肝胰脏、肌肉和肠道中GPR43 mRNA表达的差异。结果显示,克隆得到的团头鲂GPR43基因的cDNA序列全长为2026 bp,含有1个长度为981 bp的开放阅读框,编码了 326个氨基酸。RT-PCR检测发现GPR43在团头鲂的肠道、肌肉、鳃和肝胰脏中具有较高的表达。此外,在肠道组织中,与对照组相比,高脂组的GPR43表达量有明显下调(P<0.05),添加黄连素能够显著上调其表达水平(P<0.05)。同时在肝胰脏和肌肉组织中也发现了相似的变化趋势,但差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,高脂组的游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)以及细胞分裂素蛋白激酶(P38)、过氧化物酶体增值因子丫(PPARy)的定量表达均呈现了显著上升(P<0.05)的趋势,在添加了黄连素后则明显地下降了(P<0.05)。肝胰脏组织和肌肉组织中的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量变化也有着相似的趋势。而这两个组织中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量以及肉碱棕榈酰基转移酶I(CPTI)、过氧化物酶体增值因子a&β(PPARα&β)、AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的表达量均呈现出了相反的趋势。另外,正常脂肪日粮中添加黄连素并不能对上述各指标产生明显的调控效应,有时反而会产生轻微的负调控效应。以上结果表明,黄连素能够明显缓解高脂诱导的团头鲂肝胰脏脂肪沉积,改善其脂肪代谢性能,而这些作用可能跟GPR43受体有关。第三章黄连素对游离脂肪酸诱导的淡水鱼类肝细胞脂肪沉积的影响为了进一步验证黄连素作为功能性饲料添加剂对于脂肪异位沉积的调控性能及生物安全性,本研究通过体外细胞诱导试验探究了黄连素的作用对草鱼肝细胞活性以及细胞凋亡的影响,并以棕榈酸(PA)诱导肝细胞脂肪沉积,验证黄连素对脂肪过度沉积现象的调控作用。结果显示,黄连素作用6h即能对肝细胞活性产生影响,当其发挥调节作用时,随着添加浓度的提高,细胞活性逐渐降低,5μM时下降的趋势最明显(P<0.05)。同时,细胞的总凋亡率也随着黄连素浓度的增加而逐渐增加,当浓度增加到5μM时凋亡率最高(P<0.05),随后当黄连素浓度继续提高,总凋亡率降低,细胞死亡率显著增加(P<0.05)。接着将不同浓度(0.5mM、1mM、2mM、4mM)的PA添加到细胞中,油红0染色结果发现0.5mM的PA即可明显诱导肝细胞脂肪沉积(P<0.05)。通过细胞活性测定发现当PA浓度继续增加(大于0.5mM)时肝细胞的活性会受到明显的抑制(P<0.05)。因此试验选择以0.5mM的PA作为诱导肝细胞脂肪沉积的最佳浓度。而黄连素的添加能够明显缓解PA干预所致的脂肪沉积现象(P<0.05)。以上结果表明,在细胞中添加超过5μM浓度的黄连素时会对细胞产生明显的毒性效应(P<0.05);而在0.5mM PA诱导的脂肪沉积模型中,添加5μM的黄连素即能有效改善脂肪酸摄入导致的甘油三酯沉积,保持细胞的健康状态。综上所述,饲料中添加黄连素能够显著增加团头鲂的增重率,改善高脂环境导致的过氧化应激,增强其在逆性环境中的免疫性能,缓解过多脂肪摄入引发的过度细胞凋亡。同时,黄连素能够有效抑制高脂持续摄入诱导的肝胰脏脂肪异位沉积,从而修复受损的脂肪稳态,保持鱼体健康。