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烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种环境中广泛存在的腐生真菌,通过产生分生孢子进行传播,是重要的机会性致病真菌,可引起免疫受损人群的侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis,IA）,在系统性真菌感染中仅次于白假丝酵母（Candida albicans）,感染率居于第二位。在健康人体中,固有免疫可有效清除吸入的烟曲霉孢子,但对于免疫受损个体,孢子可黏附于肺上皮细胞萌发形成菌丝,进而侵袭宿主的组织和血管导致IA。由于抗真菌药物种类有限、缺乏真菌疫苗、免疫受损人群的增加及真菌耐药性的出现,使得IA呈逐年增加的趋势,病死率高达50～90%。虽然对烟曲霉的研究已取得一定的进展,但其致病机制在很大程度上仍然未知。烟曲霉基因组仍存在着大量功能未知的非编码区和未注释蛋白,而注释蛋白中仅有少数蛋白的功能被验证。T-DNA随机插入突变的方法可用于注释非编码区功能、假定蛋白功能及已知蛋白质新功能,可作为烟曲霉基因组研究和致病机制研究的有效工具。真菌的生长发育在疾病的发生和发展中发挥重要作用。研究表明,真菌的生长发育与致病力之间存在一定的联系。真菌突变株生长发育的异常,包括菌落形态、菌丝生长及孢子产生等,可表现出致病力的改变。敲除白假丝酵母三羧酸（Tricarboxylic Acid,TCA）循环的关键基因,可导致菌丝生长缺陷。敲除烟曲霉细胞壁完整性信号通路、钙调神经磷酸酶相关基因,可导致菌落生长缺陷和致病力降低。过表达孢子产生相关基因brlA可抑制烟曲霉菌丝生长并降低致病力。因此,筛选烟曲霉生长发育的调控基因,可获得烟曲霉致病相关因子,有助于注释基因功能和解析致病机制,并可为挖掘潜在的抗真菌靶标提供理论依据。本研究的主要内容如下:（1）烟曲霉生长发育异常突变株的筛选和分析为获得烟曲霉生长发育调控基因,并分析其对烟曲霉致病力的影响,本研究筛选了利用根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation,ATMT）技术构建的烟曲霉T-DNA随机插入突变体库。从3042株突变株中获得40株生长发育异常的突变株,主要包括菌落直径减小、白化、气生菌丝增多、边缘不规则及表面褶皱等形态改变。利用TD-TAIL PCR获得了突变株的T-DNA侧翼序列,确定了生长发育相关基因,为烟曲霉生长发育相关基因的功能解析、探讨致病机制奠定了基础。突变株AFM3725菌落生长缓慢,T-DNA打断了6号染色体的一段非编码区。序列分析结果表明,该非编码区在烟曲霉中具有高度保守性。通过秀丽隐杆线虫和小鼠感染模型分析了菌株的致病力。结果显示,与野生株相比,AFM3725感染动物的死亡率较低,小鼠肺部的真菌负荷与组织病理学损伤较轻,表明该非编码区缺失导致烟曲霉致病力降低。突变株AFM2954菌落生长缓慢,T-DNA打断了sat1基因,编码假定的胞内蛋白转运蛋白。序列分析结果表明,该蛋白在常见的丝状病原真菌中较保守,并且功能未见报道。通过构建定向敲除株Δsat1和回复株sat1C,进一步验证了sat1对烟曲霉生长发育的影响。镜下形态学观察结果显示,sat1基因缺失导致菌丝极性生长受损、顶囊发育异常及产孢子量减少。动物模型分析结果显示,sat1缺失降低了感染动物的死亡率,减轻了小鼠肺部的真菌负荷与组织病理学损伤,表明sat1缺失降低了烟曲霉的致病力。（2）sat1影响烟曲霉线粒体功能烟曲霉野生株与突变株的RNA-seq分析结果显示,sat1缺失后TCA循环、氧化磷酸化及细胞壁合成等相关的差异表达基因显著富集。sat1缺失后线粒体膜电位和ATP水平降低及TCA循环、氧化磷酸化相关基因的表达下调,表明sat1缺失影响线粒体功能。磷脂酰丝氨酸外翻和DNA断裂的增加及凋亡相关基因casA与casB的表达上调,表明sat1缺失可诱导烟曲霉凋亡。（3）sat1影响烟曲霉细胞壁合成sat1缺失可导致原生质体产生减少、细胞壁增厚、对细胞壁扰动剂的抵抗性增加及细胞壁成分β-1,3-葡聚糖等的含量增加,表明sat1影响了烟曲霉细胞壁合成。烟曲霉MpkA是细胞壁完整性信号通路的关键因子,Western Blot结果显示,sat1缺失增加了MpkA的磷酸化,表明sat1通过调节细胞壁完整性信号通路影响烟曲霉细胞壁合成。β-1,3-葡聚糖合成酶影响β-1,3-葡聚糖合成,是棘白菌素类抗真菌药物的靶标。药物敏感性结果显示,sat1缺失株对卡泊芬净的敏感性降低。细胞实验结果显示,sat1缺失后对肺上皮细胞和聚乙烯平面的黏附率增加,但对肺上皮细胞的损伤减少。综上,本研究通过筛选烟曲霉T-DNA随机插入突变体库,获得一些生长发育异常突变株,并确定了一些生长发育调控基因。对生长发育显著异常的两株烟曲霉突变株进行了分析。其中,突变株AFM3725打断一段非编码区,实验结果表明该非编码区影响烟曲霉生长发育和致病力。突变株AFM2954打断基因为sat1,功能尚未明确。本研究表明,sat1通过调节线粒体功能和细胞壁合成,影响烟曲霉生长发育和致病力。上述研究结果可为了解烟曲霉生长发育和致病力的调控机制奠定基础,并可为挖掘IA治疗靶点提供理论和实验依据。