论文部分内容阅读
目的:探讨奈比洛尔抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）/高糖诱导人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）上皮-间质转化（EMT）的作用及机制,为肾小管间质纤维化的治疗提供新思路。方法:（一）预实验确定AngⅡ/高糖诱导HK-2细胞EMT的适宜浓度及时间。（二）奈比洛尔抑制AngⅡ/高糖诱导HK-2细胞EMT的作用。奈比洛尔抑制AngⅡ诱导HK-2细胞EMT分组如下:空白对照组;AngⅡ（10-66 mol/L）组;奈比洛尔不同浓度（1,5,10,20μmol/L）和时间（30min,1.5h,3h）预处理组。奈比洛尔抑制高糖诱导HK-2细胞EMT分组如下:空白对照组;渗透压对照组;高糖（30 mmol/L）组;奈比洛尔不同浓度（1,5,10,20μmol/L）和时间（30min,1.5h,3h）预处理组。荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）,划痕实验测细胞迁移能力,Western Blot检测细胞α-SMA,Collagen I,Vimentin,Fibronectin和E-Cadherin蛋白表达。（三）奈比洛尔抑制AngⅡ/高糖诱导HK-2细胞EMT的机制。分组如下:空白对照组;空白对照+奈比洛尔（10μmol/L,1.5h）组;AngⅡ（10-66 mol/L,48h）/高糖（30 mmol/L,48h）组;奈比洛尔（10μmol/L,1.5h）+AngⅡ（10-66 mol/L,48h）/高糖（30 mmol/L,48h）组;空白对照+二苯基氯化碘盐（DPI）（1μmol/L,1.5h）组;DPI（1μmol/L,1.5h）+AngⅡ（10-66 mol/L,48h）/高糖（30 mmol/L,48h）组。荧光探针法检测细胞内ROS,Western Blot检测细胞NADPH氧化酶（NOX）2,NOX4,p22phox,AMPK,p-AMPK,TGF-β1,ERK1/2,p-ERK1/2蛋白表达。（四）奈比洛尔抑制转化生长因子（TGF-β1）诱导HK-2细胞EMT的作用。分组如下:空白对照组;空白对照+奈比洛尔（10μmol/L,1.5h）组;TGF-β1（10ng/mL,48h）组;奈比洛尔（10μmol/L,1.5h）+TGF-β1组;空白对照+DPI（1μmol/L,1.5h）组;DPI（1μmol/L,1.5h）+TGF-β1组。划痕实验测细胞迁移能力,Western Blot检测细胞α-SMA,E-Cadherin,Collage I,Vimentin和Fibronectin蛋白表达。结果:（一）AngⅡ（10-66 mol/L,48h）或高糖（30 mmol/L,48h）促进HK-2细胞内ROS生成,下调E-Cadherin蛋白表达、上调α-SMA蛋白表达,诱导细胞EMT。（二）奈比洛尔10和20μmol/L作用1.5和3 h可抑制AngⅡ/高糖诱导的HK-2细胞内ROS生成,但两个浓度在相同时间点无显著性差异。奈比洛尔10μmol/L作用1.5h可明显抑制AngⅡ/高糖诱导HK-2细胞EMT:降低HK-2细胞迁移能力,增加E-Cadherin蛋白表达,减少α-SMA,Collage I,Vimentin,Fibronectin蛋白表达。（三）奈比洛尔和DPI均可降低AngⅡ/高糖诱导的HK-2细胞内ROS生成。奈比洛尔减少AngⅡ诱导的HK-2细胞NOX2,NOX4,p22phox,TGF-β1,p-ERK1/2表达及p-ERK1/2/ERK1/2,但对ERK1/2表达无显著影响。另一方面,奈比洛尔增加高糖刺激下HK-2细胞AMPK和p-AMPK蛋白表达和p-AMPK/AMPK,降低NOX4,p22phox,TGF-β1,ERK1/2,p-ERK1/2表达及p-ERK1/2/ERK1/2。（四）TGF-β1（10 ng/mL,48h）可诱导HK-2细胞EMT。此作用可被奈比洛尔和DPI显著抑制:降低细胞迁移能力,增加HK-2细胞E-Cadherin蛋白表达,降低Collage I,Vimentin,Fibronectin和α-SMA蛋白表达。结论:奈比洛尔可通过抗氧化作用和抑制TGF-β1,改善AngⅡ/高糖诱导HK-2细胞EMT。