由于水产养殖业不断发展,养殖规模业逐渐增大。水产病害也接踵而至,导致世界各地养殖户严重的经济损失,限制了水产养殖业的可持续发展。细菌是海水养殖产业中最严重的病原之一。据近年来流行病学研究表明,哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大菱鲆弧菌（Vibrio scophthalmi）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselae subsp.damselae）是海水养殖中常见的病原菌。这些细菌具有致病性强、流行性广等特点。为了尽早诊断检测病原菌、降低经济损失风险,在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本文研究目的:1、建立可同步检测这五种细菌的多重微流控荧光定量PCR检测方法。2、建立同步检测对虾肝胰腺坏死病病原——Vp AHPND的pir A和pir B基因的微流控荧光定量PCR检测方法。实现重要海水养殖病原菌的微流控荧光定量PCR一步式快速检测,为开发在养殖现场应用的病原菌多重微流控检测技术奠定基础。1、哈维氏弧菌、副溶血弧菌和大菱鲆弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法的建立。本文对哈维氏弧菌的vhh A基因、副溶血弧菌的tox R基因和大菱鲆弧菌的lux R基因设计特异性引物,建立了三种菌的微流控荧光定量PCR检测技术。研究结果显示,三种方法特异性都较为良好。通过绘制标准曲线发现在10~9～10~4 copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。建立的方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌和大菱鲆弧菌的检测灵敏度分别为2.42×10copies/μL、3.83×10~2 copies/μL、2.87×10 copies/μL,具有较高的灵敏度。该方法检测时间仅需26 min,较实验室荧光定量PCR扩增时间大大缩短。因此本文建立的方法具备了现场快速检测的能力,为进一步开发微流控集成芯片一步式快速检测多个病原菌奠定了基础。2、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多重微流控荧光定量PCR现场快速检测方法的建立。本研究在实验室已有成果的基础上将哈维氏弧菌的vhh A基因、副溶血弧菌的tox R基因、大菱鲆弧菌的lux R基因、鳗弧菌的emp A基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的Mcp基因作为靶基因设计的特异性引物,通过优化反应体系和条件,在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。研究结果显示,该方法可准确检测这5种细菌。并且对5种病原菌的最低检测限分别为:4.0×10 CFU/m L、2.0×10 CFU/m L、2.0×10~2 CFU/m L、5.0×10~2 CFU/m L、2.0×10 CFU/m L,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。3、用于快速检测Vp AHPND的双重微流控荧光定量PCR方法的建立。本研究对实验室分离的一株可致对虾肝胰腺坏死病的副溶血弧菌进行国标套式PCR鉴定后,发现其携带pir A和pir B基因。以Vp AHPND特有的pir A和pir B基因为目的基因,建立双重微流控荧光定量PCR快速检测方法。研究结果显示,所建立的方法特异性良好,可以准确区分Vp AHPND和非Vp AHPND。该方法最低检测限达到10 copies/μL,具有较高的灵敏度。为现场快速诊断对虾肝胰腺坏死病提供技术支持。4、临床检测应用。实验室模拟临床样本,利用建立的方法进行检测同时用实验室荧光荧光定量PCR进行对比实验,验证其应用效果。建立的多重微流控荧光定量PCR检测方法的准确率达到普通实时荧光定量PCR检测方法的96.2%以上。对实验动物不同组织进行检测发现在鱼的鳃、虾的肌肉和鳃中的检测效果最佳。对分别加入5种纯菌液的组织部位检测,结果发现最低检测限可达到10~4 CFU/g,对加入5种菌混合液的组织部位进行检测,结果发现最低检测限为10~5 CFU/g。同时用实验室荧光定量PCR进行对比实验,发现本文建立的检测方法较实验室实时荧光定量PCR的灵敏度低一个数量级。但样品平均检测时间仅需26 min,较普通实时荧光定量PCR明显缩短。该方法可用于养殖现场病害病原菌的初步诊断。