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目的：
近视是全球发病率最高的屈光不正，其发病率逐年上升，但是发病机制尚不明确。本课题组前期研究表明，近视发生时，巩膜存在微环境缺氧，缺氧通过缺氧诱导因子HIF-1α，HIF-2α发挥功能。本课题组前期表明巩膜缺氧可通过HIF-1α调控巩膜成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化、胶原重塑导致近视形成。HIF-2α是否参与缺氧诱导的近视形成尚不明确。在豚鼠实验中发现，整合素α1β1受体在近视眼发育的早期阶段起到调节作用，而α2β1受体则参与了近视的加深。在肿瘤研究中发现了HIF-1α和整合素连接激酶（ILK）之间的调节反馈回路，这样提供了癌细胞在低氧条件下维持高水平HIF-1α表达和上皮间充质分化的基础，HIF-1α参与了整合素的调控，同时上皮间充质分化，从另一方面证明其产物可参与细胞外基质的重塑，进而证明整合素参与细胞外基质重塑。然而HIF-2α与整合素的机制尚不明确。而HIF-1α与HIF-2α的功能存在一定的联系，故而猜测HIF-2α与整合素存在一定的联系，因此在研究HIF-1α的同时研究HIF-2α。本研究将利用小鼠形觉剥夺性近视模型，明确巩膜HIF-1α、HIF-2α在巩膜整合素表达调控、细胞外基质重塑及近视发生发展中的作用及其机制。
材料与方法：
1.明确小鼠近视形成过程中HIF-1α、HIF-2α、胶原1α1(COL1α1)、整合素α1(ITGα1)、整合素α2(ITGα1)、整合素β5(ITGβ5)表达的动态改变：4周龄雄性野生型C57BL/6小鼠，形觉剥夺2天、形觉剥夺2周，检测巩膜HIF-2α、HIF-1α、COL1α1、ITGα1、ITGα1、ITGβ5的mRNA水平和蛋白水平的变化。
2.明确敲减小鼠巩膜HIF-2α对小鼠屈光发育和近视形成的影响：
利用基因型Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒（腺病毒相关的CRE重组酶）敲减巩膜上的HIF-2α，并以注射AAV8-Vector为空载体对照，明确其对屈光发育和形觉剥夺的影响：
1）对屈光发育的影响：4周龄Hif2αflox/flox小鼠，在病毒注射前及注射2周、4周后分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，检测巩膜HIF-1α、HIF-2α蛋白表达水平以及mRNA水平，以明确Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒的敲减效率及特异性，同时检测巩膜COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对整合素表达调控、COL1α1表达变化的影响
2）对形觉剥夺性近视的影响：4周龄Hif2αflox/flox小鼠AAV8-Cre病毒注射1周后进行形觉剥夺诱导2周，在病毒注射前、及形觉剥夺诱导2周后（4周和7周龄）分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数。参数测量后检测巩膜HIF-2α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α并诱导形觉剥夺对HIF-1α的表达调控、HIF-2α的表达调控、整合素的表达调控以及对细胞外基质重塑的影响。
3.利用成纤维细胞特异性表达Cre小鼠（S100a4Cre）与Hif2αflox/flox小鼠交配得到基因型为S100a4creHif2αflox/flox的小鼠，以特异性敲减成纤维细胞的HIF-2α，从而敲减巩膜HIF-2α，并以同窝仔Cre阴性小鼠（Hif2αflox/flox）为对照。明确其对正常屈光发育和形觉剥夺诱导的影响。
1）对屈光发育的影响：对S100a4creHif2αflox/flox及Hif2αflox/flox小鼠4周龄、6周龄、8周龄时分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，同时检测巩膜HIF-2α蛋白表达水平以及mRNA水平，以明确S100a4creHif2αflox/flox小鼠HIF-2α的敲减效率及特异性，同时检测巩膜HIF-1α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对HIF-1α的表达调控、整合素表达调控、细胞外基质重塑的影响
2）对形觉剥夺性近视的影响：4周龄S100a4creHif2αflox/flox及Hif2αflox/flox小鼠形觉剥夺2周后检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，同时检测巩膜HIF-1α、HIF-2α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对HIF-2α的表达调控、HIF-1α的表达调控、整合素表达调控、细胞外基质重塑的影响
结果：
1.野生型小鼠经过2天，小鼠巩膜HIF-2α的mRNA没有显著改变；形觉剥夺2周，HIF-2α的mRNA表达水平没有明显改变，而蛋白水平显著上调。
2.Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒敲减HIF-2α
1)敲减效率检测：与注射AAV8-Cre病毒的对侧眼相比注射眼巩膜HIF-2α的mRNA和蛋白水平分别降低43%和87.7%。而对角膜、视网膜的HIF-2α表达没有显著影响。
2)对屈光发育的影响：Hif2αflox/flox小鼠在病毒注射后2周、4周的屈光检测结果显示，与注射对照病毒相比，敲减HIF-2α对小鼠屈光发育没有显著影响；注射4周后，对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平没有明显影响。
3)对形觉剥夺性近视的影响：
与注射空载体组相比，敲减HIF-2α可抑制形觉剥夺性近视的发生，对HIF1α、HIF-2α、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5都有降低作用。
3.成纤维细胞特异性敲减HIF-2α动物模型
1）敲减效率
与对照基因鼠Hif2αflox/flox小鼠相比，HIF-2α条件性敲除S100a4creHif2αflox/flox小鼠巩膜HIF-2α的mRNA水平和蛋白水平的敲除效率分别是34.4％和82.0%，而对视网膜、角膜、晶状体的HIF-2α没有显著影响
2）对正常屈光发育的影响
与对照Hif2αflox/flox小鼠相比，HIF-2α条件性敲除S100a4creHif2αflox/flox小鼠HIF-2α对屈光发育没有显著影响。对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平没有明显影响
结论：
敲减小巩膜HIF-2α对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达没有显著影响，对屈光发育没有显著影响。并且敲减HIF-2α对形觉剥夺诱导的COL1α1、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的表达有抑制作用，同时敲减HIF-2α抑制近视。提示HIF-2α可以通过抑制形觉剥夺性近视，同时降低整合素α1、α2、β5的表达。
近视是全球发病率最高的屈光不正，其发病率逐年上升，但是发病机制尚不明确。本课题组前期研究表明，近视发生时，巩膜存在微环境缺氧，缺氧通过缺氧诱导因子HIF-1α，HIF-2α发挥功能。本课题组前期表明巩膜缺氧可通过HIF-1α调控巩膜成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化、胶原重塑导致近视形成。HIF-2α是否参与缺氧诱导的近视形成尚不明确。在豚鼠实验中发现，整合素α1β1受体在近视眼发育的早期阶段起到调节作用，而α2β1受体则参与了近视的加深。在肿瘤研究中发现了HIF-1α和整合素连接激酶（ILK）之间的调节反馈回路，这样提供了癌细胞在低氧条件下维持高水平HIF-1α表达和上皮间充质分化的基础，HIF-1α参与了整合素的调控，同时上皮间充质分化，从另一方面证明其产物可参与细胞外基质的重塑，进而证明整合素参与细胞外基质重塑。然而HIF-2α与整合素的机制尚不明确。而HIF-1α与HIF-2α的功能存在一定的联系，故而猜测HIF-2α与整合素存在一定的联系，因此在研究HIF-1α的同时研究HIF-2α。本研究将利用小鼠形觉剥夺性近视模型，明确巩膜HIF-1α、HIF-2α在巩膜整合素表达调控、细胞外基质重塑及近视发生发展中的作用及其机制。
材料与方法：
1.明确小鼠近视形成过程中HIF-1α、HIF-2α、胶原1α1(COL1α1)、整合素α1(ITGα1)、整合素α2(ITGα1)、整合素β5(ITGβ5)表达的动态改变：4周龄雄性野生型C57BL/6小鼠，形觉剥夺2天、形觉剥夺2周，检测巩膜HIF-2α、HIF-1α、COL1α1、ITGα1、ITGα1、ITGβ5的mRNA水平和蛋白水平的变化。
2.明确敲减小鼠巩膜HIF-2α对小鼠屈光发育和近视形成的影响：
利用基因型Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒（腺病毒相关的CRE重组酶）敲减巩膜上的HIF-2α，并以注射AAV8-Vector为空载体对照，明确其对屈光发育和形觉剥夺的影响：
1）对屈光发育的影响：4周龄Hif2αflox/flox小鼠，在病毒注射前及注射2周、4周后分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，检测巩膜HIF-1α、HIF-2α蛋白表达水平以及mRNA水平，以明确Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒的敲减效率及特异性，同时检测巩膜COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对整合素表达调控、COL1α1表达变化的影响
2）对形觉剥夺性近视的影响：4周龄Hif2αflox/flox小鼠AAV8-Cre病毒注射1周后进行形觉剥夺诱导2周，在病毒注射前、及形觉剥夺诱导2周后（4周和7周龄）分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数。参数测量后检测巩膜HIF-2α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α并诱导形觉剥夺对HIF-1α的表达调控、HIF-2α的表达调控、整合素的表达调控以及对细胞外基质重塑的影响。
3.利用成纤维细胞特异性表达Cre小鼠（S100a4Cre）与Hif2αflox/flox小鼠交配得到基因型为S100a4creHif2αflox/flox的小鼠，以特异性敲减成纤维细胞的HIF-2α，从而敲减巩膜HIF-2α，并以同窝仔Cre阴性小鼠（Hif2αflox/flox）为对照。明确其对正常屈光发育和形觉剥夺诱导的影响。
1）对屈光发育的影响：对S100a4creHif2αflox/flox及Hif2αflox/flox小鼠4周龄、6周龄、8周龄时分别检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，同时检测巩膜HIF-2α蛋白表达水平以及mRNA水平，以明确S100a4creHif2αflox/flox小鼠HIF-2α的敲减效率及特异性，同时检测巩膜HIF-1α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对HIF-1α的表达调控、整合素表达调控、细胞外基质重塑的影响
2）对形觉剥夺性近视的影响：4周龄S100a4creHif2αflox/flox及Hif2αflox/flox小鼠形觉剥夺2周后检测小鼠屈光、眼轴等眼轴生物学参数，同时检测巩膜HIF-1α、HIF-2α、COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平以明确敲减HIF-2α对HIF-2α的表达调控、HIF-1α的表达调控、整合素表达调控、细胞外基质重塑的影响
结果：
1.野生型小鼠经过2天，小鼠巩膜HIF-2α的mRNA没有显著改变；形觉剥夺2周，HIF-2α的mRNA表达水平没有明显改变，而蛋白水平显著上调。
2.Hif2αflox/flox小鼠Tenon`s囊下注射AAV8-Cre病毒敲减HIF-2α
1)敲减效率检测：与注射AAV8-Cre病毒的对侧眼相比注射眼巩膜HIF-2α的mRNA和蛋白水平分别降低43%和87.7%。而对角膜、视网膜的HIF-2α表达没有显著影响。
2)对屈光发育的影响：Hif2αflox/flox小鼠在病毒注射后2周、4周的屈光检测结果显示，与注射对照病毒相比，敲减HIF-2α对小鼠屈光发育没有显著影响；注射4周后，对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平没有明显影响。
3)对形觉剥夺性近视的影响：
与注射空载体组相比，敲减HIF-2α可抑制形觉剥夺性近视的发生，对HIF1α、HIF-2α、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5都有降低作用。
3.成纤维细胞特异性敲减HIF-2α动物模型
1）敲减效率
与对照基因鼠Hif2αflox/flox小鼠相比，HIF-2α条件性敲除S100a4creHif2αflox/flox小鼠巩膜HIF-2α的mRNA水平和蛋白水平的敲除效率分别是34.4％和82.0%，而对视网膜、角膜、晶状体的HIF-2α没有显著影响
2）对正常屈光发育的影响
与对照Hif2αflox/flox小鼠相比，HIF-2α条件性敲除S100a4creHif2αflox/flox小鼠HIF-2α对屈光发育没有显著影响。对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达水平没有明显影响
结论：
敲减小巩膜HIF-2α对COL1α1、HIF-1α、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的蛋白表达没有显著影响，对屈光发育没有显著影响。并且敲减HIF-2α对形觉剥夺诱导的COL1α1、ITGα1、ITGα2、ITGβ5的表达有抑制作用，同时敲减HIF-2α抑制近视。提示HIF-2α可以通过抑制形觉剥夺性近视，同时降低整合素α1、α2、β5的表达。